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1.
2.
目的:构建人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration,hALR)15kD亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂(Cisplatin,DDP)诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法:用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法和基因重组技术,从重组质粒pPIC9K-rhALR中扩增出编码rhALR基因片段,将其克隆入pPICZαA质粒中构建重组质粒pPICZα-A-rhALR。重组质粒SacⅠ酶切线性化后电转入酵母GS115中,并在1%的甲醇诱导下表达。表达上清蛋白经Western blot(ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体)鉴定和镍柱亲和层析纯化。MTS试剂检测rhALR体外对人肝癌细胞(HepG2、QGY)的促增殖活性,及流式细胞仪检测rhALR在顺铂诱导QGY细胞凋亡中的抗凋亡作用。结果:PCR、双酶切、DNA测序均鉴定重组质粒构建与预期一致。分泌表达的rhALR约占上清总蛋白的70%,目的分子量约17 kD,Western blot均可见单一条带。纯化后的rhALR对HepG2和QGY的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强(HepG2组:F=246.729,P=0.000;QGY组:F=246.004,P=0.000),且在QGY细胞顺铂诱导凋亡时也发挥着浓度梯度式抗凋亡作用(F=101.061,P=0.000)。结论:成功构建高效分泌表达rhALR的pPICZα-A-rhALR GS115真核表达系统;体外实验证实rhALR对顺铂诱导人肝癌细胞有呈浓度依赖性的抗凋亡作用。 相似文献
3.
超声微泡造影剂介导VEGF基因治疗大鼠心肌缺血的实验性研究 总被引:31,自引:6,他引:31
目的:探讨超声微泡造影剂介导血管内皮生长因子(VEGF)基因转染大鼠缺血心肌的有效性。方法:将15只急性心肌梗塞3天后的雄性Wistar大鼠分为3组,每组5只,第一组采用超声破坏微泡造影剂的方式将pcD2VEGF121基因转染大鼠心肌约6分钟;第二组尾静脉输入同等剂量携pcD2VEGF121基因的造影剂;第三组为对照。2周后,分别行免疫组织化学检测缺血心肌中的VEGF蛋白及毛细血管内皮细胞,结果:采用超声微泡造影剂介导的VEGF基因转染,能明显增强VEGF基因在大鼠心肌组织内的表达,并可促进缺血心肌组织新生血管,结论:超声微泡造影剂介导的VEGF基因治疗是一种无创、新型、高效的基因转移方法。 相似文献
4.
目的 研究转化生长因子(TGF) β1的小干扰RNA (siRNA)对CCl4诱导肝纤维化大鼠TGFβ1/Smad信号通路的影响.方法 以前期研究的TGFβ1siRNA治疗前后肝纤维化大鼠肝脏组织作为研究对象,分为正常组、模型组、TGF β 1 siRNA 0.125 mg/kg组、TGFβ1 siRNA 0.25 mg/kg组和阴性对照组(0.25 mg/kg非特异性靶序列).用免疫组织化学和Western blot检测Smad2、3、4、7的蛋白表达;Real-time PCR法检测Smad2、3、4、7的mRNA表达.多组间数据比较用方差分析,两两比较采用q检验. 结果 免疫组织化学结果显示TGF-β1 siRNA 0.25mg/kg组及0.125 mg/kg组Smad2/3、4的蛋白表达量较模型组、阴性对照组明显减少(F值分别为115.538,117.178,P< 0.01),TGFβ 1 siRNA 0.25 mg/kg组表达量较0.125 mg/kg组少(P<0.05).TGFβ 1 siRNA 0.25 mg/kg组及0.125 mg/kg组Smad7的蛋白表达量较模型组、阴性对照组增加(F=125.34,P< 0.01),TGFβ 1 siRNA 0.25mg/kg组表达量较0.125 mg/kg组多(P<0.05).Western blot结果与之相似.Real-time PCR结果显示,与模型组和阴性对照组比较,TGFβ1 siRNA可以明显抑制Smad 2、3、4基因的表达,且TGFβ1 siRNA 0.25 mg/kg组Smad2、3、4的mRNA表达量(相对表达量分别为2.870±0.705、2.904±0.414、2.667±0.466)较TGF β1siRNA 0.125 mg/kg组(相对表达量分别为5.998±0.329、5.827±0.781、5.102±0.102)明显减少(P<0.05).TGFβ1 siRNA 0.25mg/kg组及0.125 mg/kg组Smad7的mRNA表达量较模型组、阴性对照组增加(F=29.615,P<0.01),TGFβ1 siRNA 0.25 mg/kg组表达量较0.125mg/kg组多(P<0.05).结论 TGFβ1 siRNA干扰大鼠TGFβ1表达后,Smad2、3、4表达量明显降低,而Smad7表达仍维持在较高水平,这利于肝纤维化的改善. 相似文献
5.
通过链霉蛋白酶P、N-糖苷酸F、O-糖苷酶、唾液酸酶水解低分子量肝细生长素,以探讨低分子量肝细胞生长素(HPN)的理化性质与生物活性。 一、材料与方法 1.材料:(1)低分子量肝细胞生长素(HPN):以乳猪肝脏为原料制备、纯化出的分子量约为6.54×10~3的耐热、促进肝细胞生长物质的纯品(研究所自行纯化)。(2)链霉蛋白酶P、NP40购自美国Sigma公司;N-糖苷酸F、唾液酸酶、O 糖苷酶购自美国Roche公司;~3H-TdR:购于北京中国原子能研究院,浓度为37×10~6Bq/ml,用前以RPMI1640培养基稀释,每10μl培养墓含37×10~3Bq~H-TdR。其余试剂购自北方同正公司和重庆医药有限公司试剂部。(3)QGY细胞由重庆医科大学病毒性肝炎研究所提供。 相似文献
6.
【目的】 探讨丙酮酸乙酯(EP)抑制脓毒症巨噬细胞表达和释放HMGB1的相关分子机制?【方法】将小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7分为LPS和LPS+ EP组,分别采用100 ng/mL LPS和100 ng/mL LPS+ 5 mmol/L EP刺激,于刺激后不同的时间点,Western blot检测细胞总蛋白内p-p38MAPK?CBP的含量变化以及胞质和胞核内NF-κB的含量;用免疫细胞化学?激光共聚焦显微镜观察培养细胞内p-p38MAPK?NF-κB和CBP的变化;Real-time PCR检测培养细胞HMGB1的mRNA水平,ELISA检测培养上清HMGB1的蛋白含量?【结果】 LPS和LPS+ EP刺激后2~6 h,细胞内p-p38MAPK蛋白含量逐渐增加,但LPS+ EP组p-p38MAPK蛋白含量明显低于LPS组;NF-κB在细胞质内的含量逐渐减少,而在细胞核内的含量逐渐增多,而LPS+ EP组NF-κB从胞质到胞核的移位明显弱于LPS组;细胞内CBP的蛋白含量逐渐增加,但LPS+ EP组明显低于LPS组?随着p-p38MAPK?NF-κB和CBP等蛋白的变化,LPS和LPS+ EP刺激后24?36和48 h,LPS+ EP组细胞内HMGB1 mRNA表达比LPS组明显减少;在LPS和LPS+ EP刺激后18~48h,LPS+ EP组培养上清中HMGB1蛋白含量明显低于LPS组?【结论】 EP通过抑制单核-巨噬细胞内的信号分子p-p38MAPK?NF-κB?和 CBP的表达,从而抑制LPS诱导单核-巨噬细胞表达和释放HMGB1? 相似文献
7.
目的 探讨重组大鼠肝再生增强因子(rrALR)对庆大霉素所致急性肾衰竭(ARF)大鼠肾小管上皮细胞及肾功能的保护作用。 方法 雌性Wistar大鼠150只,随机分成5组,每组30只,即健康对照组,ARF模型组,模型+空质粒对照组(空质粒组),模型+rrALR干预组(ALR组):根据给予rrALR的剂量不同分为ALR1组和ALR2组两个亚组。分别于实验的第4、8、12、16和21天每组随机抽取6只大鼠在留取血、尿标本后,处死大鼠并取肾组织标本。常规生化方法检测各组大鼠BUN、Scr和尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)酶的变化;PAS染色观察各组大鼠肾组织病理学改变;免疫组化法检测大鼠肾组织中ALR和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;Western印迹法检测肾组织中ALR蛋白的表达量。 结果 ARF大鼠各组BUN、Scr及尿NAG酶水平在第4、8、12、16天时均较对照组显著升高(P < 0.05)。与模型组和空质粒组相比,ALR组BUN、Scr及尿NAG酶水平明显降低(P < 0.05);肾组织病理损害程度在各时间点明显减轻;而肾组织的ALR蛋白表达增加(P < 0.05);肾小管上皮细胞增殖活跃;PCNA阳性细胞呈弥漫性分布,增殖指数(PI)明显升高(P < 0.05)。 结论 rrALR对急性损伤的肾小管上皮细胞具有减轻病变和促进再生修复的作用,可明显改善ARF大鼠的肾功能。 相似文献
8.
IL-10、TNF-α对慢性乙型肝炎患者树突状细胞的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 研究IL-10和TNF-α对慢性乙型肝炎患者树突状细胞的分化与功能的影响.方法 健康志愿者和慢性乙型肝炎患者各15例,取外周静脉血,分离获得外周血单个核细胞(PBMC),常规培养获得DC组.培养期间用IL-10刺激的为imDC组;TNF-α刺激的为mDC组;先后用IL-10、TNF-α刺激的为imDC+TNF-α组.各组收获细胞后分别检测反映DC成熟度的各种分子及其体外诱导的自体淋巴细胞增殖效应.结果 源于慢性乙型肝炎患者的常规培养的Dc在数量,HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86表达,IL-12p70分泌及其诱导的淋巴细胞增殖效应,均低于健康者组(P<0.01).源于慢性乙型肝炎患者的mDC与健康者mDC表达的HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86比较无显著性差异;2组mDC诱导自体淋巴细胞增殖效应和分泌的IL12p70均明显增加,比较有显著性差异(P<0.01);2组imDC的HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86低表达,分泌的IL-12p70极低,不能强烈激活诱导淋巴细胞增殖效应,与DC组比较有显著性差异(P<0.01).加入TNF-α刺激后HLA-A、B、C,HLA-DR,CD86仍低表达,分泌的IL-12pT0和淋巴细胞增殖效应仍较低.健康对照组、慢性乙型肝炎组的上清夜中IL-21的ELISA检测值均较低,无显著性差异.结论慢性乙型肝炎患者常规培养的DC在数量和功能上低于健康者.TNF-α可促进常规培养的DC成熟为mDC、IL-10可抑制DC成熟.慢性乙型肝炎患者的DC同健康者一样可进行有效的调控,分化成熟后功能强于健康者常规培养的DC,或可提高自体DC治疗性疫苗在不同免疫状态下的治疗效果. 相似文献
9.
10.
目的:研究基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)1和2的siRNA对CCl4诱导的肝纤维化大鼠Smad7蛋白表达的影响。方法:采用前期构建的TIMP-1 siRNA、TIMP-2 siRNA治疗肝纤维化大鼠的肝脏组织作为研究对象,分为正常组、模型组、阴性对照组(0.25 mg/kg非特异性靶序列)、TIMP-1 siRNA 0. 25 mg/kg组和TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组。Real-time PCR法检测Smad7的mRNA表达;免疫组织化学、Western blot检测Smad7的蛋白表达。结果:Real-time PCR结果显示TIMP-1 siRNA 0.25 mg/kg组(59.7±3.3)%、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组(60.2±3.4)% Smad7的mRNA表达量均较模型组(28.0±1.6)%、阴性对照组(28.6±1.7)%明显增加(P=0.000);免疫组织化学结果显示TIMP-1 siRNA 0.25mg/kg组(8.55±0.67)、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组(8.23±0.85)Smad7的蛋白表达量均较模型组(4.25±0.53)、阴性对照组(4.19±0.55)明显增加(P=0.000)。Western blot结果显示TIMP-1 siRNA 0.25 mg/kg组(0.706±0.039)、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组(0.698±0.038)Smad7的蛋白表达量均较模型组(0.278±0.013)、阴性对照组(0.285±0.014)明显增加(P=0.000)。结论:TIMP-1 siRNA、TIMP-2 siRNA对于肝纤维化Smad7的表达有促进作用。 相似文献