SEMA3B基因真核表达载体的构建及对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的构建抑癌基因SEMA3B真核表达载体pc DNA3.1-SEMA3B,并检测其对肺癌A549细胞恶性生物学行为的影响。方法应用PCR扩增SEMA3B全长c DNA片段,构建真核表达载体pc DNA3.1-SEMA3B。克隆PCR、双酶切法、基因测序验证过表达载体构建成功。将pc DNA3.1-SEMA3B真核表达载体和空载体pc DNA3.1分别转染入A549细胞中,应用qRT-PCR、Western blot检测SEMA3B mRNA、蛋白表达水平的变化;MTS法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期;克隆形成实验检测细胞集落形成能力。结果 SEMA3B基因扩增片段与预测片段一致,克隆成功,且测序鉴定证实真核表达载体构建成功。转染pc DNA3.1-SEMA3B真核表达载体可上调SEMA3B mRNA、蛋白表达水平,且可抑制A549细胞的增殖,诱导凋细胞亡,细胞被阻滞在G1期,抑制细胞集落形成能力。结论成功构建了SEMA3B基因真核表达载体,抑癌基因SEMA3B在肺癌恶性生物学进程中可能发挥重要作用。     

uPA和PAI-1基因克隆及真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆人卵巢上皮癌组织uPA和PAI-1基因cDNA全长,构建表达uPA和PAI-1基因的真核表达载体。方法：采用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA和PAI-1基因的cDNA全长,克隆到pGEM-TEasy Vector上,通过酶切和测序进行鉴定;酶切后与真核表达载体pcDNA3.1/myc-his（-）B连接,酶切及测序再次鉴定;采用脂质体法将重组质粒DNA转染至卵巢癌上皮细胞SKOV3细胞;采用有限稀释法和G418分别加压筛选并培养SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞及对照细胞;Western blot法检测转染前后SKOV3细胞uPA和PAI-1基因的表达。结果：成功扩增出uPA和PAI-1基因的cDNA的全长,并克隆入T载体,DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3.1-uPA和pcDNA3.1-PAI-1,Western blot能检测到uPA和PAI-1基因蛋白分别在SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞中的表达。结论：成功构建了uPA和PAI-1表达基因的真核表达载体,为进一步研究uPA和PAI-1基因在卵巢癌侵袭转移中的作用提供了实验基础。     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

ZBTB5基因真核表达质粒的构建及其在HEK 293T细胞中的表达

目的构建ZBTB5基因的真核表达质粒,并检测其在细胞内的表达。方法以pET-28a(+)-ZBTB5质粒为模板,以ZBTB5全长编码基因特异性引物进行PCR扩增,将ZBTB5全长基因插入至pcDNA3.1-GFP真核表达载体构建重组pcDNA3.1-ZBTB5-GFP质粒。将该重组质粒双酶切及测序鉴定后,转染至HEK 293T中,荧光显微镜下及Western blot分别检测GFP和ZBTB5在细胞中的表达。同时设置pcDNA3.1和pcDNA3.1-GFP载体为对照。结果酶切及测序证实成功构建了真核表达重组载体pcDNA3.1-ZBTB5-GFP。荧光显微镜下可见GFP的表达,Western blot检测到融合蛋白ZBTB5-GFP的表达。结论成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-ZBTB5-GFP,为探讨其进一步的功能奠定基础。     

人同源盒基因NKX3.1cDNA真核表达载体的构建及表达

目的：构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC 3、LNCaP中的表达情况。方法：以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,T/A克隆至pCR2.1载体中。经酶切、测序鉴定后,将NKX3.1cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中。将pcDNA3.1 NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP 细胞,RT PCR和Western blot法检测NKX3.1cDNA在转录水平和蛋白水平的表达。结果：人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1经酶切及测序鉴定正确。 pcDNA3.1 NKX3.1转染PC 3和LNCaP细胞后,经RT PCR和Western blot证明在mRNA和蛋白水平均能有效表达NKX3.1。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染前列腺癌细胞PC 3和LNCaP后能有效表达。     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

人LIF基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆白血病抑制因子(LIF)基因,测定其序列,构建带LIF基因的真核表达载体.方法:通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从正常妊娠的子宫蜕膜组织中克隆LIF基因,与T载体连接,再酶切T-LIF载体,获得LIF基因,然后将其与质粒PCDNA3.1( )连接,构建PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体.结果:经酶切和DNA测序证明LIF基因序列正确,载体构建成功.结论:成功克隆了LIF基因,构建了PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体,为LIF在相应真核细胞内表达及LIF蛋白的分离纯化奠定了基础.     

小鼠GATA4基因真核表达载体的构建及其在P19细胞中的表达

目的:构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,检测其在P19细胞中的表达.方法:由于GATA4基因的全长编码区的GC含量很高,因此本实验采用分段克隆后PCR拼接的方法获得GATA4基因的全长编码序列,连接入pMD19-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pCDNA 3.1A,构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,测序验证无误后,采用脂质体介导法转染至P19细胞,Western blot检测其在P19细胞中的表达.结果:成功扩增小鼠GATA4基因全长编码区,测序证明重组真核表达载体pCDNA3.1A-GATA4构建成功,Western blot确认目的基因在P19细胞中过表达.结论:pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体构建成功,并在P19细胞内过表达,将为研究其在心肌分化、心脏发育中的功能奠定基础.     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及...     

12-ACS/pcDNA3.1-VEGF121纳米粒的制备及应用

目的 利用基因工程技术构建的pcDNA31-VEGF121真核表达质粒,制备由12-烷基化壳聚糖包裹的纳米粒,并将其在体外对基因DNA的保护作用进行检验. 方法 采用碱裂解法白转化阳性细菌菌液中提取出pcDNA3.1-VEGF121真核表达质粒;采用复凝聚法制备基因-壳聚糖纳米粒12-ACS/pcDNA31-VEGF1...     

pcDNA-DEST47-miR-29b重组质粒的构建及其对VEGF表达的靶向调控作用

目的构建has-miR-29b重组表达载体,并探讨其对VEGF表达的靶向调控作用。方法利用生物信息学方法预测has-miR-29b与VEGF-3＇UTR的结合位点;将PCR扩增的miR-29b前体序列和pcDNA-DEST47载体经酶切后连接,构建pcDNA-DEST47-miR-29b表达载体;采用荧光素酶检测法和Western blot法证实miR-29b对VEGF蛋白表达的抑制作用。结果 psiCHECK2-VEGF荧光素酶报告质粒和pcDNA-DEST47-miR-29b两种质粒共转染组的荧光素酶活性明显低于单独转染的空载体组和Lu-VEGF组（P〈0.01）,同时发现其他种类miRNA（Let-7g）不能抑制VEGF荧光素酶活性,而miR-29b明显抑制VEGF荧光素酶活性;转染pcDNADEST47-miR-29b质粒后在Jurkat细胞中VEGF蛋白的表达明显受抑制。结论本研究成功构建pcDNADEST47-miR-29b重组质粒;miR-29b与VEGF具有靶向关系,且miR-29b参与其调控作用。     

人雌激素受体α真核表达载体构建及质粒免疫制备多克隆抗体

目的：克隆构建表达人雌激素受体仅（ERα）的真核表达质粒,并探讨通过质粒免疫的方法制备ERa抗体的可行性。方法：利用RT—PCR方法从MCF一7细胞中克隆出ERα基因,并将其构建在pCDNA3．1载体中,质粒经鉴定为正确后,大量提取重组质粒,利用脂质体转染试剂包裹,肌肉注射免疫BALB／c小鼠,通过测定血清抗ERα效价,观察重组质粒携带ER仪在小鼠体内的表达情况。结果：成功克隆构建了表达ERα的真核载体,细胞内瞬时转染实验证实重组质粒成功表达目的蛋白;通过采用该质粒免疫小鼠,获得了高效价的小鼠多克隆抗体,经验证抗体可识别内源性ERα。结论：采用真核表达质粒进行免疫制备ER仅抗体具有可行性,为进一步通过质粒免疫制备ERα单克隆抗体奠定基础。     

A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达

目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒（HRSV）G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,酶切鉴定后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3．1（＋）G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到G基因有转录,Western blotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。