呼吸道合胞病毒A,B亚型变异的进一步研究

利用抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体，通过间接免疫荧光法和免疫转印法对本室分离到的武汉地区１９８８年－１９９３年的７２株呼吸道合胞病毒进行了分型，可奖其分为Ａ、Ｂ两型和Ｂ１、Ｂ２亚型；其中，Ａ型株占２９．２％，Ｂ型株占７０．９％。流行病学分析显示，本地区呼吸道合胞病毒流行株５年中有４年以Ｂ型株为主；Ａ、Ｂ两型的分布还局灶化特点；两型在性别、发病年龄方面无显著性差异。     

呼吸道合胞病毒A、B亚型变异的进一步研究

利用抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体，通过间接免疫荧光法和免疫转印法对本室分离到的武汉地区1988年～1993年的72株呼吸道合胞病毒进行了分型，可将其分为A、B两型和B_1、B_2亚型；其中,A型株占29.2％，B型株占70.9％。流行病学分析显示，本地区呼吸道合胞病毒流行株5年中有4年以B型株为主；A、B两型的分布还具有局灶化特点；两型在性别、发病年龄方面无显著性差异。     

呼吸道合胞病毒诱导COX-2的表达

目的 研究呼吸道合胞病毒(RSV)感染BMh/c鼠及A549细胞(人肺腺癌上皮细胞)COX-2表达的变化,初步探讨COX-2在RSV感染所致炎性反应中的作用.方法 以1×106PFU/ml RSV感染体外培养的A549细胞,在感染后8、16和24 h,采用免疫细胞化学法检测COX-2蛋白表达;以1×106PFU/ml RSV滴鼻感染Balb/c鼠,在感染后24、48和96 h,用免疫组化法检测肺组织COX-2蛋白表达,并对肺组织切片行HE染色;以未感染病毒的Balb/c鼠及A549细胞作正常对照.采用生物图像分析系统对免疫组化和免疫细胞化学结果进行COX-2定量检测.用TRlzol提取肺组织和A549细胞总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测COX-2 mRNA表达的变化.结果 正常细胞对照组中,A549细胞COX-2 mRNA和蛋白有微弱表达,经由RSV感染后,A549细胞COX-2 mRNA和蛋白有高水平表达,差异有显著性(P<0.05),且随着感染时间的延长,其表达量逐渐增加.正常鼠肺组织中COX-2 mRNA和蛋白仅有微弱表达,RSV感染后,COX-2 mRNA和蛋白表达水平随感染时间延长而增加,差异具有显著性(P<0.05);HE染色显示肺组织炎症随感染时间延长而加重,且COX-2的表达水平与肺组织炎症严重程度相一致.结论 RSV感染可诱导肺组织及A549细胞高水平表达COX-2 mRNA和蛋白,并可能参与RSV感染引起的肺组织炎性反应.     

呼吸道合胞病毒蛋白G基因l核苷酸分析

目的:对河南省呼吸道合胞病毒(RSV)进行分离与鉴定.方法:选择2006年冬季至2007年春季河南省部分医院急性呼吸道感染患者,采集咽拭子,利用Hep-2细胞和Vero细胞进行病毒分离,对分离株用特异性RTPCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行蛋白G全基因序列测定,并进行同源性分析,构建基因进化树.结果:共分离到4株RSV毒株,各分离株之间核苷酸同源性92%～99%;与A型RSV标准参考株的核苷酸同源性为86%～92%,与B型RSV标准株的同源性为70%.结论:2006年河南省RSV流行株为A型.     

人呼吸道合胞病毒病理特征分析

目的 系统分析人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)对体内外不同细胞影响的病理学变化特征.方法 将 HRSV A2株病毒接种到人二倍体KMB17细胞、VERO细胞,同时接种小鼠、乳鼠、豚鼠,通过病理切片及电镜切片检查,分析体内外不同细胞的感染变化情况.结果 HRSVA2株病毒对VERO细胞感染力强于二倍体KMB17,细胞;小鼠及乳鼠脑内接种不引起死亡,没有炎症细胞浸润;豚鼠鼻腔接种主要感染下呼吸道及肺部,引发浸润性病变,对核膜、核仁均产生损伤,肺及组织片状坏死.结论 VERO细胞适于HRSVA2株的病毒培养;豚鼠可作为HRSV毒力评价的动物模型.     

呼吸道合胞病毒F蛋白基因片段原核表达和初步应用

目的:建立呼吸道合胞病毒快速、敏感、特异、廉价的早期血清学检测方法.方法:从北京儿童医院患者鼻咽分泌物分离的呼吸道合胞病毒中,用RT-PCR的方法扩增出RSVF蛋白的F1区部分基因片段F1-1(AA137～363),此区域包含F蛋白的主要中和抗原位点.将该基因片段克隆到pMD18-T载体,将连接质粒经PCR鉴定,证实插入目的片段.酶切后将该片段与pET-32a表达质粒连接,用限制性内切酶酶切及序列测定,证实插入片段的正确性.利用pET-32a表达质粒在大肠杆菌BL21表达正确的RSVF1-1蛋白.重组蛋白N端包含有6个连续的组氨酸标签,通过镍离子金属鏊合亲和层析纯化,获得了高纯度的目的重组蛋白RSVF1-1,然后将重组RSVF1-1包被建立间接ELISA法检测人血清中的RSVF蛋白IgG抗体.结果:RT-PCR产物的片段大小为678bp.经酶切和测序鉴定后,插入序列无误.Western Blot分析显示:重组蛋白具有较好的抗原性.用该蛋白建立的间接ELISA方法检测结果与进口Euroimmun和维润试剂盒检测结果比较,差异无显著性.结论:F蛋白基因片段的成功表达为进一步开发诊断试剂盒提供了实验依据.     

B亚型呼吸道合胞病毒毛细支气管炎临床研究

目的 了解呼吸道合胞病毒(RSV)的亚型感染情况及其所致毛细支气管炎的临床特点。方法 对121例临床诊断为毛细支气管炎患儿的鼻咽分泌物采用巢氏PCR方法进行RSV及亚型检测，并分析亚型感染患儿的临床资料。结果 ①：RSV阳性87例(71．9％)，其中A亚型60例，B亚型27例；②Bierman’s病情评分显示B亚型毛细支气管炎的临床症状较A亚型轻，恢复快；③A、B亚型RSV感染毛细支气管炎患儿在发病年龄、发热、血气、胸片上无显著性差异；④与间接免疫荧光等方法相比较，巢氏PCR是检测RSV灵敏度较高的方法。结论 B亚型RSV毛细支气管炎的临床症状较A亚型为轻。     

人呼吸道合胞病毒Long株的免疫原性初探

目的 评价人呼吸道合胞病毒（HRSV） Long株的免疫原性,为进一步的研究疫苗提供实验数据.方法 将HRSV制备成纯化抗原,取40只ICR鼠,随机分为4组,分别用纯化HRSV、纯化HRSV＋ Al（OH）3、并设0.01 mol/L PBS、Al（OH）3对照组,0天、28天免疫小鼠,采用中和试验检测血清中和抗体,流式检测7种细胞因子.结果 初免后28天,加Al（OH）3组与无Al（OH）3组抗体阳转率分别为60％和50％,抗体几何平均效价（GMT）分别为1∶4.49和1∶5.27;加强免疫后,Al（OH）3组与无Al（OH）3组小鼠血清抗体阳转率均达100％,抗体几何平均效价（GMT）分别为1∶17.15和1∶10.56,平均增长3.8倍和2.0倍;中和抗体在组间无差异,而组内初免与再免的中和抗体有统计学差异（P＜0.01）.加Al（OH）3样品组与无Al（OH）3样品组,所检测7种细胞因子均诱导IL-6及TNF,与两个对照组间有统计学差异（P＜0.05）,而另外5种细胞因子则无明显升高.结论 人呼吸道合胞病毒Long株可产生良好的免疫效应.     

广州地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因序列分析

目的：探讨广州地区呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因变异的生物学意义，为研究广州地区BSV感染特点及RSV疫苗提供依据。方法：用PT—PCR的方法从广州地区呼吸道合胞病毒分离株98159株的细胞培养物中扩增出编码其表面蛋白G的基因片段，克隆至pGEM—T载体中并进行序列测定。结果：序列测定结果与A亚型原型株A2抹、1990年中国北京地区分离株B79G蛋白的核苷酸序列比较核苷酸同源率分别为92．7％及98．4％；由核苷酸序列推导的氨基酸序列的同源率分别为88.3％及97．0％。一些重要的免疫反应位点发生了变异。结论：RSVG蛋白抗原结构变异大，在研制疫苗时应注意选用株的地区性。     

RANTES启动子-403G／A基因多态性与呼吸道合胞病毒致毛细支气管炎的相关性研究

目的:探讨正常T淋巴细胞表达和分泌的活性调节蛋白(regulated on activation,normal T cell expressed and secreted,RANTES)启动子-403G/A基因多态性与呼吸道合胞病毒(RSV)致毛细支气管炎(简称毛支)的相关性.方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测238例RSV毛支患者及288例正常对照者RANTES基因-403G/A多态性,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清总IgE浓度.结果:RSV毛支组-403G/A基因型及等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05),但RSV毛支组-403G/A 3个基因型间个体特应性体质阳性率及特应性家族史阳性率比较有显著差异(P＜0.05),并且携带-403A等位基因个体发生特应性体质的危险性是GG纯合子个体的2.57倍(P＜0.05).RSV毛支组-403G/A基因型间血清IgE水平差异有显著性(P＜0.05).结论:中国汉族人群RANTES启动子-403G/A基因多态性可能与RSV毛支易感性无关联,但-403A等位基因可能为特应性体质的易感因素.     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因转染对人肺腺癌细胞生长特性的影响

目的:探讨人呼吸道合胞病毒(hRSV)M2-1基因转染对人肺腺癌细胞体外生长特性的影响.方法:应用脂质体转染法,将携带M2-1基因的重组载体pXJ-41/M2-1转入人肺腺癌PAa和A549细胞,并获稳定表达;以不含M2-1基因的空白载体为对照,采用流式细胞术、MTT法、胰酶消化试验、软琼脂集落形成实验和Boyden小室等方法观察转染细胞的生长特性、贴壁能力及侵袭能力变化.结果:与转染前和转染空白质粒组比较,转染M2-1基因的PAa和A549细胞的G2/M期细胞比例均显著增加(P<0.05,P<0.01);细胞增殖明显加快(P<0.01),倍增时间缩短;集落形成率显著增加(P<0.01);PAa细胞胰酶消化离壁时间缩短(P<0.01),而A549细胞在3组间无统计学差异;Boyden小室实验中,A549细胞透膜数显著增加(P<0.01),而PAa细胞因透膜数很少,均无法计数.结论:M2-1基因转染能提高体外培养的PAa和A549细胞的增殖能力和侵袭能力,感染hRSV病毒的肺癌患者应引起重视.     

RSV与HRV在ALRTI住院儿童中的流行状况和临床特征比较

目的:了解RSV和HRV在ALRTI住院儿童中流行病学和临床特征的异同。方法:收集2007年9月~2008年8月ALRTI住院患儿NPA样本,进行病毒核酸检测,统计分析RSV和HRV检出病例的流行状况、临床特点。结果:1165名患儿检出RSV 315例(27.0%),HRV 202例(17.3%);性别之间检出率无统计学差异;RSV检出患儿平均年龄13.1±14.3月,1岁以下检出率最高,且明显高于同年龄段HRV检出率;HRV检出患儿平均年龄15.8±17.8月,1岁检出率最高,并高于同年龄段RSV检出率;RSV检出以11月份到次年2月份为高峰;HRV检出以4月份、9~12月份为高峰;与RSV比较,HRV检出病例临床特点除末梢血白细胞计数升高较多见外,其它均无差异;与单一RSV检出病例比较,RSV混合其它病毒检出病例并发症较多,且末梢血白细胞计数升高较多见;单一HRV检出病例未见发绀,其余临床特点与混合其它病毒检出病例无差异。结论:RSV和HRV是长沙地区ALRTI住院儿童的重要病原体,两者在年龄、季节分布上有不同,临床特点无明显差别。     

呼吸道合胞病毒地方株SH蛋白基因序列分析

目的 :分析我国呼吸道合胞病毒 (RSV)地方株SH蛋白基因的遗传特点、变异特征。方法 :从本室保存的不同年份、不同地区、不同流行特征的呼吸道合胞病毒地方株中抽取 7株 ,分别用RT PCR扩增其SH蛋白基因并克隆到PTZ18R载体中进行了序列测定和分析。结果 :我国RSV地方株间SH蛋白基因相比较变异的部位及形式很相似 ,地方株间核苷酸全序列的同源性为 97.0 %～ 10 0 %。结论 :RSV在我国不同地区的不同流行特征与SH蛋白基因的变异无明显关系     

特异性脱氧核酶对小鼠呼吸道合胞病毒感染的抑制作用

目的 研究特异性抑制呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)N基因的脱氧核酶DZ1133在小鼠体内对病毒复制和气道炎症的影响.方法 RSV感染BALB/c小鼠滴鼻给予DZ1133及其变异体、反义寡核苷酸AS1133,空斑形成实验检测肺组织病毒滴度,RT-PCR检测病毒mRNA表达,支气管肺泡灌洗液白细胞计数,ELISA检测TNF-α、IL-12、IFN-γ和IL-10水平,肺组织病理学分析炎症情况.结果 0.2、0.4 mg和0.8 mg DZ1133治疗组小鼠肺组织病毒滴度分别为(2.75±0.21)×105、(1.86±0.20)×105PFU/g和(1.02±0.22)×103PFU/g,与感染对照组小鼠(7.94±0.42)×105PFU/g比较明显下降(P<0.01),上述各剂量治疗组小鼠肺组织病毒mRNA表达与感染对照组比较分别下降30.51%、47.38%(P<0.05)和53.97%(P<0.01).0.4 mg DZ1133治疗降低RSV感染小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞总数,改善肺组织病理学损伤(P<0.05),对TNF-α、IL-12、IFN-γ和IL-10水平无显著性影响(P>0.05).结论 特异性脱氧核酶DZ1133在小鼠体内有效抑制RSV复制、减轻气道炎症,是有效的抗RSV途径.     

呼吸道合胞病毒对人肺腺癌细胞系PAa的影响

目的：探讨呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染对体外培养人肺腺癌细胞系ＰＡａ的影响。方法：应用ＲＳＶ体外感染ＰＡａ细胞,观察ＰＡａ细胞的变化：聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合单链构象多态性分析（ＳＳＣＰ）检测ＰＡａ细胞ｐ５３基因突变情况。结果：ＲＳＶ感染ＰＡａ细胞２４ｈ后,细胞出现融合病变,形成巨融合细胞;病变细胞ｐ５３第５、６、７、８、９外显子突变热点区域未见单链多态性变化。结论：ＲＳＶ对ＰＡａ细胞形态影响明     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的:原核表达呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS1蛋白,并对其免疫特性进行研究.方法 采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a(+)载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性.结果 重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确,经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达,表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42 000 Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Western blot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15 000 Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带.结论 NS1基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应.     

人呼吸道合胞病毒非结构蛋白研究进展

病毒的非结构蛋白是一类由病毒基因组编码、存在于病毒培养液上清但不存在于病毒颗粒中的蛋白。有的病毒的非结构蛋白可直接参与病毒基因组的复制和表达调控,也有的可通过与宿主细胞组分相互作用,间接协助病毒复制和感染。人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,hRSV）是世界各地儿童严重呼吸道感染中最重要的病原,且能重复感染患者。hRSV是单股负链病毒目副黏液病毒科肺病毒属的成员之一,包括A和B两个抗原亚型。其基因变异快,目前A亚型含有11个基因型,B亚型含有22个基因型[1]。