过表达miR-218增强食管鳞状细胞癌对顺铂敏感性

目的 研究miR-218 在食管鳞癌细胞中对顺铂药物敏感性的影响.方法 采用递增药物浓度、间歇冲击作用的方法构建耐药细胞株;实时荧光定量PCR检测miR-218 在食管鳞癌细胞株Eca109 与顺铂耐药株Eca109-CisR差异性表达;进一步在顺铂耐药株Eca109-CisR中过表达miR-218:① CCK8实验检测细胞增殖;② 流式细胞仪检测细胞凋亡率;③ Western blot方法检测凋亡抑制蛋白Survivin、Mcl-1及Bcl-2的相对表达量.结果 miR-218在顺铂耐药株Eca109-CisR细胞中呈低表达;过表达 miR-218 增加顺铂耐药株Eca109-CisR对顺铂的药物敏感性;Western blot结果证实凋亡相关蛋白Survivin、Mcl-1 及 Bcl-2相对表达减少.结论 miR-218表达有助于增加食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性,且给对顺铂耐药的食管鳞癌患者提供潜在的基因治疗靶点.     

青蒿琥酯与阿霉素联用对人食管癌细胞生长及凋亡的影响

目的 探讨青蒿琥酯(AS)与阿霉素(ADM)联合应用对人食管癌细胞Ec9706生长及凋亡的影响,并探讨其机制.方法 应用流式细胞仪检测AS与ADM联合应用前后人食管癌细胞Ec9706凋亡率及细胞内ADM的含量;应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法 检测AS作用前后细胞三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)mRNA的表达.结果 ADM单独作用24 h后,Ec9706细胞的凋亡率同对照组比较显著性增高(P<0.05).AS与不同浓度的ADM联合作用后,Ec9706细胞的凋亡率及细胞内ADM的含量同单独应用ADM组比较显著增高(P<0.01).RT-PCR检测发现AS作用24 h后Ec9706细胞ABCG2 mRNA表达显著降低(P<0.05).结论 ADM对人食管癌细胞Ec9706具有生长抑制和诱导凋亡的作用,AS可以使其作用明显增强,其发生机制可能是通过AS下调ABCG2 mRNA表达,增加细胞内ADM的含量而实现的.     

NHE-1特异性抑制剂DMA逆转HL-60/ADM细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨钠/氢交换器-1(Na /H exchanger-1, NHE-1)特异性抑制剂二甲基氨氯吡咪(dimethyl amiloride, DMA)是否能在体外逆转耐药细胞株HL-60/ADM的多药耐药及其可能机制.方法 以阿霉素诱导产生多药耐药(multidrug resistance, MDR)的HL-60/ADM细胞株为研究对象,用MTT法检测化疗药物敏感性,流式细胞仪检测细胞内柔红霉素积累量,RT-PCR法检测mrp、bcl-2、bax mRNA表达,免疫细胞化学法检测细胞膜多药耐药相关蛋白(MRP)表达,TUNEL法检测原位细胞凋亡.结果 与50 μmol/L DMA共同培养24 h后,HL-60/ADM细胞对ADM、MIT、VCR、HAR 4种化疗药物的IC50值分别由(839.5±45.2 )、(321.2±28.9)、(70.5±15.5)、(65.2±20.7)ng/ml降低至(180.5±38.9)、(76.4±12.0)、(30.2±7.5)、(31.7±7.2)ng/ml;分别与50、100 μmol/L DMA共培养24 h后,HL-60/ADM细胞内DNR积累量荧光强度由作用前的33.56升高到48.74和70.10,细胞内mrp mRNA表达量、MRP蛋白表达量及bcl-2 mRNA表达量明显降低,bax mRNA表达量明显升高;与100 μmol/L DMA共同培养24 h后,5 μg/ml ADM作用下的HL-60/ADM细胞凋亡率明显增高.结论 DMA可逆转HL-60/ADM细胞的MDR,其机制可能与下调MRP表达及促进bcl-2/bax凋亡途径有关.     

姜黄素逆转肝癌耐药性实验研究

目的 研究姜黄素对人肝细胞癌耐药株HepG2/ADM耐药逆转作用,并初步探讨其逆转机制.方法 通过培养液阿霉素浓度梯度递增法建立HepG2/ADM细胞株,采用MTT法检测其耐药性,免疫组化法检测HepG2/ADM与亲本株P-gp的表达.采用姜黄素作用于HepG2/ADM细胞,MTT法测定其逆转倍数,高效液相色谱法(HPLC)测定细胞内ADM含量.结果 HepG2/ADM细胞表现出多药耐药性,P-gp的表达较亲本细胞明显增多,加用姜黄素后HepG2/ADM细胞耐药性有明显逆转,细胞内ADM浓度明显升高. 结论姜黄素可以逆转HepG2/ADM细胞的耐药性,提高该细胞对化疗的敏感度,其逆转机制可能与降低P-gp对药物的外排功能,增加细胞内药物浓度有关.     

青蒿琥酯抗人食管癌作用与调控CDC25A表达的关系

目的 观察青蒿琥酯(artesunate, Art)对人食管癌Eca109细胞株及裸鼠移植瘤的抑瘤作用,探讨Art诱导肿瘤细胞周期阻滞是否与CDC25A表达有关.方法 MTT法测定Art对Eca109细胞及正常人外周血单个核细胞(hPBMC)增殖的影响;流式细胞术(FCM)测定肿瘤细胞的周期变化;观察Art对裸鼠人食管癌移植瘤的抑制情况; 采用RT-PCR及Western blotting方法检测CDC25A mRNA和蛋白表达情况.结果 Art能显著抑制Eca109细胞的增殖, IC50为 (68.80±0.76)μmol/L,而在刀豆蛋白A(concanavalin A, Con A)刺激下hPBMC的增殖则没有明显抑制作用.低浓度Art可将细胞阻滞于G0/G1期,S期细胞显著减少,当浓度达到100 μmol/L时,Art可将细胞阻滞于G2/M期.Art对裸鼠肿瘤的体积抑瘤率最高可达76.4%,质量抑瘤率可达33.2%.Art可显著抑制Eca109细胞CDC25A mRNA及蛋白表达.结论 Art可抑制食管癌细胞及裸鼠移植瘤的生长,且无明显毒副作用,通过下调CDC25A的表达而调控细胞周期,是Art发挥抑瘤作用的重要机制.     

褪黑素联合顺铂对人食管癌Eca109细胞的抑制作用及其机制

目的:观察褪黑素(Mel)联合顺铂(DDP)对人食管癌Eca109细胞生长的抑制作用,并探讨相关的分子机制。方法:通过MTT实验检测Mel与DDP不同浓度分别单用或两药联合处理后食管癌Eca109细胞增殖情况;流式细胞仪检测用药后细胞凋亡情况;Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:Mel与DDP联用对食管癌Eca109细胞增殖的抑制率均高于单用Mel与DDP时对食管癌Eca109细胞的抑制率(P<0.05);Mel单独诱导食管癌Eca109细胞凋亡作用不强,但可增强DDP诱导的食管癌细胞凋亡(P<0.01);Mel与DDP联用后食管癌Eca109细胞Bcl-2蛋白表达减弱,Bax蛋白表达增强。结论:Mel可增强DDP对人食管癌Eca109细胞增殖的抑制作用,并具有增强DDP诱导人食管癌Eca109细胞凋亡的作用,其机制可能与上调Bax表达和下调Bcl-2的表达有关。     

靶向MDR1基因siRNA逆转HepG2/ADM细胞耐药性的研究

目的 采用RNA干扰技术逆转人类肝癌细胞系/阿霉素(human hepatocellular liver carcinoma cell line/adriamycin,HepG2/ADM)细胞中多耐药基因,探讨该基因能否有效地抑制多耐药基因(multidrug resistance gene,MDR1)及其编码的糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达,并检测对HepG2/ADM耐药表型的逆转效果.方法 采用药物大剂量冲击法建立HepG2/ADM耐药模型,构建靶向MDR1的小干扰RNA表达载体,并转染到HepG2/ADM细胞中,应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测基因转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,Western-blot检测各组细胞P-gp蛋白表达的变化,用噻唑蓝法检测各组细胞对阿霉素、顺铂、长春新碱和氟尿嘧啶等药物的敏感性.结果 HepG2/ADM细胞系不仅对阿霉素耐药,而且对其他化疗药也有抗性,呈现多药耐药特性;重组质粒鉴定结果表明针对MDR1的小干扰RNA表达载体成功构建;与对照组比较,转入细胞后MDR1 mRNA水平明显下降,P-gp蛋白表达明显降低;转入细胞后HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性明显提高,部分逆转其耐药性.结论 靶向MDR1的小干扰RNA可显著抑制HepG2/ADM细胞中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,逆转P-gp介导的HepG2/ADM细胞的耐药性.     

survivin反义寡核苷酸对肝癌耐药细胞的作用及与化疗的关系

目的研究survivin反义寡核苷酸对人肝癌耐药细胞株的增殖和凋亡情况,以及对阿霉素化疗敏感性的影响。方法将人肝癌耐药细胞系SMMC-7721/ADM分为脂质体转染组、阿霉素组、正义寡核苷酸转染组、正义寡核苷酸转染 阿霉素组、反义寡核苷酸转染组、反义寡核苷酸转染 阿霉素组共6组。MTT法检测细胞相对存活率,流式细胞仪分析细胞凋亡率变化,RT-PCR和Westernblot印迹法检测细胞survivinmRNA和蛋白表达。结果survivin-ASODN作用后的人肝癌耐药细胞SMMC-7721/ADM的细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。survivinmRNA和survivin蛋白表达:脂质体转染对照组、阿霉素组、正义寡核苷酸转染对照组、正义寡核苷酸转染对照 阿霉素组之间survivin蛋白表达无明显差异(P>0.05)。400ng/mlsurvivingASODN组和400ng/mlASODN 阿霉素组survivinmRNA较其他4组显著降低(P<0.05),但其两组之间表达无明显差异(P>0.05)。结论survivin反义寡核苷酸能降低肝癌耐药细胞survivin表达,增强人肝癌耐药细胞对阿霉素的化疗敏感性。     

微波热疗对人乳腺癌阿霉素细胞MCF-7多药耐药蛋白及耐药性的影响

目的探讨微波热疗对人乳腺癌阿霉素细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞MCF-7/ADM的多药耐药蛋白表达和耐药性的影响。方法应用Real-TimePCR法检测微波热疗对P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响和高效液相色谱法(HPLC)检测微波热疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果MCF-7/ADM细胞在微波热疗后4h和24h,P-gp、MRP表达量明显下降(P<0.01)。微波热疗以后肿瘤细胞内阿霉素(ADM)浓度有明显上升(P<0.01)。结论微波热疗抑制了耐药蛋白的表达,增加了细胞内的药物浓度,热疗可能是逆转化疗耐药从而提高化疗效果的一种有效手段。     

表面标志物Cripto-1表达对食管癌干细胞生长的作用机制研究

目的:探讨表面标志物Cripto-1(CR-1)的表达对食管癌干细胞生长的作用机制.方法:自食管癌Eca109细胞中分选Eca109干细胞,提取正常食管上皮细胞HEEC和Eca109细胞、Eca109干细胞总蛋白,采用Western-blot法检测CR-1表达水平;构建CR-1基因沉默载体CNE2/CR-1 -及过表达载体CNE1/CR-1 +,利用脂质体转染法将CNE2/CR-1 -和CNE1/CR-1 +分别转染进Eca109干细胞中,并设对照组,采用RT-PCR法检测CR-1表达;MTT法检测对照组、CNE2/CR-1 -组、CNE1/CR-1 +组Eca109干细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组Eca109干细胞凋亡情况;Western-blot法检测各组细胞Akt、p-Akt蛋白表达情况.结果:Eca109细胞及Eca109干细胞中CR-1表达均明显高于HEEC(P<0.01).RT-PCR结果显示,CNE2/CR-1 -组CR-1表达水平明显低于对照组,CNE1/CR-1 +组明显高于对照组(P<0.01).MTT结果显示,CNE2/CR-1 -组细胞增殖明显低于对照组,CNE1/CR-1 +组明显高于对照组(P<0.01).流式细胞仪检测显示,CNE2/CR-1 -组细胞凋亡率明显高于对照组, CNE1/CR-1 +组细胞凋亡率明显低于对照组(P<0.01).Western-blot结果显示,CNE2/CR-1 -组p-Akt蛋白表达明显低于对照组,CNE1/CR-1 +组p-Akt蛋白表达明显高于对照组(P<0.01);而Akt蛋白表达未出现明显变化(P>0.05).结论:CR-1作为潜在的食管癌干细胞标记物,可能通过PI3K/Akt信号通路调控食管癌干细胞的增殖与凋亡.     

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

  目的  探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸（ASODN）对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。  方法  采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸（N-ODN）链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组（5、10、15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞）、对照组（细胞常规培养,不进行细胞转染）、SODN组（细胞转染15 μmol/L的SODN）和N-ODN组（细胞转染15 μmol/L的N-ODN）。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。  结果  与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低（P<0.05）。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、N-ODN组比较差异有统计学意义（P<0.05）。15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高（P<0.05）。  结论  HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路可能有关。     

抗阿霉素人食管癌Eca-109细胞生物学特性研究

目的： 建立并研究抗阿霉素人食管癌细胞株（Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ） 的生物学特性。方法： 采用递加培养液中药物浓度建立Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞株,测试该细胞株对多种抗肿瘤药物的敏感性,采用光镜及扫描电镜观察其形态变化,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ） 分析法检测ｍｄｒ １ 表达,采用荧光分光光度法检测细胞内ＧＳＨ 水平。结果： 建立了低程度的抗阿霉素Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞株,该细胞株细胞大小不均匀,边界不如Ｅｃａ １０９ 细胞整齐,有明显皱褶,未见微毛,集落形成率明显下降,对长春新碱、放线菌素Ｄ、三尖杉酯碱、丝裂霉素Ｃ、鬼臼乙叉甙及顺铂呈不同抗性,对氟尿嘧啶仍敏感,ｍｄｒ １ 基因呈低表达,细胞内ＧＳＨ 水平升高,结论：Ｅｃａ １０９／Ａｄｒ 细胞为多药抗药性细胞株。     

仙鹤草水提液对食管癌Eca109细胞生长的抑制作用

目的:研究仙鹤草水提液对人食管癌Eca109细胞生长的抑制作用及其可能机制.方法:MTT法测定0g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L、16 g/L的仙鹤草水提液分别作用于Eca109细胞24 h、48 h、72 h,观察对Eca109细胞生长的抑制作用;采用免疫组织化学染色技术检测16 g/L仙鹤草水提液作用72 h对Eca109细胞Bcl-2、P53蛋白表达的影响.结果:MTT结果显示16 g/L仙鹤草水提液作用48 h和72 h后Eca109细胞生长明显受抑;免疫组化结果显示16 g/L仙鹤草水提液作用72 h后Eca109细胞内Bcl-2蛋白表达下调,P53蛋白表达上调.结论:仙鹤草水提液体外能诱导Eca109细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2蛋白表达及上调P53蛋白表达有关.     

S1P5对食管癌细胞Eca109黏附能力的影响

目的研究S1P5对食管鳞癌Eca109细胞黏附能力的影响。方法从人正常食管黏膜上皮克隆S1P5基因,构建表达载体S1P5-EGFP,转染Eca109细胞,经G418筛选,获得S1P5-EGFP/Eca109稳定细胞株。以对照载体Control-EGFP转染的Eca109细胞作为对照,荧光显微镜下观察细胞的形态,用黏附试验评价其黏附能力。结果成功构建S1P5-EGFP和Control-EGFP载体并转染Eca109细胞获得稳定细胞株。S1P5表达于细胞膜并使细胞略呈梭形改变。S1P5过表达致Eca109细胞黏附能力明显低于对照（P〈0.05）,并且不受其配体1-磷酸鞘氨醇（S1P）的影响。结论 S1P5组成性抑制Eca109细胞的黏附能力,食管癌细胞可能通过下调S1P5的表达增强其黏附。     

Effects of Oxymatrine on the Apoptosis of Human Esophageal Carcinoma Eca109 Cell Line and Its Mechanism

The effects of Oxymatrine （Oxy） on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma Ecal09 cell line and the mechanism were investigated. The human esophageal carcinoma Eca 109 celis were cultured in vitro. The Oxy-induced apoptosis of Eca 109 cells was assayed by using flow cytometry. The expressions of p-ERKII2, Cyclin D1, p21^waf/cipl, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot. Flow cytometry revealed that Oxy could induce the apoptosis of Eca l09 cells. Western blot showed that Oxy of different concentrations suppressed the expressions of p-ERK1/2, Cyclin D1 and Bcl-2, but up-regulated the expression of p21waf/cip1 and Bax, and the ratio of Bax/Bcl-2 was increased. It was suggested the Oxy could induce the apoptosis of Eca l09 cells, which might be related to the upregulation of p21waf/cip1 and the downregulation of p-ERK1/2, Cyclin D1 and p21^waf/cip1. The possible pathway may be related to Bcl-2/Bax.     

云芝多糖-B对人食管癌细胞Eca109转移的影响

【目的】 应用新型云芝多糖-B(CVPs-B)作用食管鳞癌Eca109细胞,探讨其对Eca109细胞转移特性的作用?【方法】 Western blot检测CVPS-B作用后,食管鳞癌Eca109细胞CXCL12蛋白表达的变化,Transwell侵袭实验评估食管癌细胞侵袭能力的变化,MTT法观察食管癌细胞与Matrigel胶黏附能力的变化,划痕法检测食管癌细胞迁移能力的变化?【结果】 实验组Eca109细胞CXCL12蛋白表达水平较对照组显著降低(P < 0.05)?CVPs-B孵育后,食管癌Eca109细胞黏附?侵袭及迁移能力下降?【结论】CVPs-B降低食管癌细胞CXCL12蛋白表达,有效抑制食管癌Eca109细胞的转移潜能,提示CVPs-B可能可以通过CXCL12/CXCR4通路抑制食管鳞癌细胞转移特性?     

白藜芦醇抑制食管癌Eca109细胞增殖的初步研究

目的观察白藜芦醇对人食管癌Eca109细胞增殖影响及凋亡诱导作用。方法噻唑蓝法测定细胞生长抑制率,倒置显微镜、透射电镜和HE染色法观察细胞的形态变化,流式细胞术用于检测白藜芦醇培养Eca109细胞前后的细胞凋亡情况。结果白藜芦醇对Eca109细胞生长有抑制作用,抑制率达76.42%,并呈剂量、时间效应关系。倒置显微镜下可见细胞生长明显被抑制,胞浆内颗粒增多增粗,部分细胞变圆悬浮在培养基中;HE染色和透射电镜观察发现白藜芦醇能诱导Eca109细胞呈现典型的细胞凋亡特征,如细胞体积变小,染色质浓缩等。流式细胞术检测结果显示,40 mg/L白藜芦醇培养Eca109细胞72 h后细胞凋亡率达19.52%,在DNA直方图上有明显的亚二倍体凋亡峰。结论白藜芦醇能明显抑制Eca109细胞增殖,并进一步诱导食管癌细胞凋亡。     

miR-155对食管癌EC109细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 研究microRNA-155(miR-155)对高转移性人食管癌EC109细胞增殖和侵袭等生物学行为的影响.方法 以人食管癌EC109基因组DNA为模板,经PCR法扩增miR-155的前体序列,通过BamHⅠ和HindⅢ双酶切后将其亚克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-);然后将构建成功的pcDNA3.1(-)-pri-miR-155载体(命名为p-miR-155)体外瞬时转染人食管癌EC109细胞,利用qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)法检测mR-155成熟体的表达水平,并利用MTT实验、克隆形成实验和划痕法检测EC109细胞的增殖、克隆形成以及体外迁移能力.结果 成功构建携miR-155的真核表达载体;与空白(Mock)和对照组(p-Ctrl)相比,转染后的EC109细胞过表达miR-155、p-miR-155载体转染组EC109细胞的增殖抑制明显增加(P<0.01),同时克隆形成能力(在100和1000个细胞/孔接种条件下)明显下降(P<0.01),以及伤口愈合能力下降(P<0.01).结论 过表达miR-155可显著抑制人食管癌EC109细胞的增殖和迁移能力,为食管癌的治疗提供了潜在的策略.     

肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用的研究

目的研究肿瘤特异性Caspase-8表达载体对食管癌细胞Eca109体外增殖和凋亡作用。方法用脂质体法将人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子调控的肿瘤特异性表达载体hTERT-Caspase-8,瞬时转染端粒酶阳性的食管癌细胞株Eca109及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5。结果转染hTERT-Caspase-8对细胞Eca109的生长具有显著抑制作用,细胞凋亡水平显著升高;转染hTERT-Caspase-8对MRC-5的生长和凋亡均无明显影响。结论上述发现提示hTERT启动子可以调控Caspase-8基因在食管癌细胞中靶向性表达,选择性抑制肿瘤细胞生长,促进肿瘤细胞凋亡,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件。