紫外线致Hep—G2细胞凋亡的分子机制初探

紫外线(UV)是人类最常接触的具基因毒作用的因子。为探索紫外线辐射致细胞凋亡和组织损伤的分子机制，本研究采用免疫细胞化学技术与特异性抗体初步探索了经紫外线辐射处理的Hep-G2细胞P53、Caspase3、bcl—2和P21等与细胞凋亡和生长抑制基因的表达情况。结果表明经紫外线辐射处理的Hep-G2细胞的P53、Caspase3和bcl—2基因表达增加，而P21未见明显改变，提示P53、Caspase基因在紫外线辐射诱导的细胞凋亡中起重要作用，bcl—2增高可能有抑制细胞的过度凋亡。保持内在平衡的作用。P21保持不变或下降可能反映了细胞对DNA损伤应答的新途径。     

RNA干扰体外抑制HBeAg的表达

目的：构建乙型肝炎病毒前C／C基因小发夹RNA（shRNA）表达载体，探索shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制作用。方法：用基因重组技术构建shRNA表达载体，经酶切、测序鉴定后，与HBeAg表达载体pcDNA3．1-preC／C按7：1的比例，共转染HeLa细胞，采用半定量PCR和微粒子酶免疫试验（MEIA）分析shRNA表达载体对HBeAg表达的抑制情况。结果：经限制性内切酶、测序证实成功构建shRNA表达载体；筛选到psiHBV2载体对HBeAg表达有一定抑制作用，对mRNA的抑制率为75％，对蛋白质的抑制率为53％，其余两序列无明显抑制作用。结论：RNAi技术可以有效抑制载体pcDNA3．1-preC／C表达HBeAg。     

用人肝细胞cDNA文库制备Dig-Fas探针

为探索SLE发生、发展与Fas表达的关系 ,本文采用降落PCR技术、分子克隆技术和Fas特异性引物 ,将从人肝细胞cDNA文库中扩增的FascDNA插入T -easyvector中 ,转染JM10 9,经耐药性和lacZ插入失活筛选 ,快速细胞裂解法、限制性内切酶酶切片段和PCR扩增试验分析鉴定 ,确证获阳性转化子。然后采用地高辛化学连接标记和查见方法 ,标记扩增、分离和纯化的FascDNA ,经斑点免疫实验证实获高滴度Dig -FascDNA探针     

重组P_(53)基因在HepG-2中的表达及作用

为进一步探索正常Ｐ５３ 对肿瘤细胞增殖的抑制作用,本文用磷酸钙 ＤＮＡ共沉淀法,将本室构建的ＰＸＴ１ Ｐ５３ 真核表达细胞转移至ＨｅｐＧ ２ 肝癌细胞系内,经斑点杂交技术和间接免疫荧光技术证实,外源性Ｐ５３ 基因已在ＨｅｐＧ ２ 细胞中稳定表达,导入的Ｐ５３基因亦能抑制ＨｅｐＧ ２ 肝癌细胞系增殖并诱导其凋亡。实验结果提示正常Ｐ５３ 基因可成为治疗不同肿瘤的重要靶分子之一。     

重组P_(53)基因表达及其与Fas关系初探

为观察重组ＰｘＴ１－Ｐ５３在真核细胞中的表达及其与Ｆａｓ表达的关系，笔者采用磷酸钙—ＤＮＡ共沉淀法，ＤＥＡＥ—莆聚糖介导的ＤＮＡ转染法将ＰｘＴ１－Ｐ５３转移至ＰＡ３１７细胞内，并用抗Ｐ５３和抗Ｆａｓ抗体，经间接免疫荧光法证实转染ＰｘＴ１－Ｐ５３的ＰＡ３１７细胞不仅能表达Ｐ５３蛋白，而且亦能表达Ｆａｓ抗原。本实验结果表明笔者构建的ＰｘＴ１－Ｐ５３确实能在真核细胞内表达，并提示Ｐ５３可能通过其转录因子活性，诱导Ｆａｓ等基因表达，以阻止不能修复的已损伤ＤＮＡ的细胞发生恶性转化     

S1P1受体细胞模型的构建及其功能特性的初步研究

目的构建1型1-磷酸鞘氨醇受体（S1P1）的细胞模型，初步探讨其介导的功能特性。方法用PolyFect，将包含全长人S1P1编码区与EGFP融合基因的载体HA-S1P1-Myc-EGFP-N1转入CHO细胞，经G418筛选，获得S1P1-EGFP-CHO稳定细胞株。以空载体pEGFP—N1转染的cHO稳定细胞株作为阴性对照，镜下观察细胞的形态。100nM FTY720处理S1P1-EGFP-CHO细胞5、24小时后用荧光显微镜观察S1P1在细胞上的表达。结果成功构建S1P1-EGFP-CHO细胞模型，表达S1P1的细胞变圆，FTY720导致该细胞模型的S1P1长时间内化。结论S1P1-EGFP-CHO细胞可作为S1P1功能特性研究的细胞模型，S1P1能使细胞变圆，FTY720能导致S1P1长时间内化。     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

川北地区胃癌特异性表达基因的克隆

目的：构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,筛选胃癌特异表达基因。方法：取胃低分化腺癌组织和癌旁正常黏膜组织,提取总RNA,逆转录cDNA,进行SSH构建消减文库获得序列标签,与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索。结果：以癌旁正常黏膜组织为driver、胃低分化腺癌组织为tester成功构建cDNA消减文库,测序结果与公共数据库中已知基因和人类EST比较,获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。结论：应用SSH法成功构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,初步筛选胃癌部分表达基因,为寻找川北地区胃癌发生发展的特异性基因奠定基础。     

重组p53基因在HepG2中的表达及作用

1. 材料与方法：(1)扩增、分离、纯化PXT1-p53[1]。(2)用磷酸钙-DNA共沉淀法将重组PXT1-p53导入HepG2细胞,加G418（400μg/L）筛选转染p53基因的阳性克隆。(3)用斑点杂交试验及间接免疫荧光技术检测p53在HepG2细胞中的表达[2]。(4)观察p53对HepG2细胞的作用：测定转染和未转染p53的HepG2细胞的生长曲线,比较分析其生长速度;用倒置显微镜、电镜观察转染和未转染p53的HepG2细胞形态改变特征,以确定细胞凋亡情况;用Hoechst 33258对HepG2细胞DNA染色,于荧光显微镜下观察染色结果;用琼脂糖凝胶电泳检测HepG2细胞DNA降解。2. …