抑制性消减杂交筛选食道癌相关基因

目的筛选食道癌发生、发展和转移过程中表达变化的基因。方法使用基于抑制性PCR技术的消减杂交方法,对食道鳞状上皮细胞癌组织与癌旁正常黏膜组织cDNA进行消减杂交,并对食道癌组织表达发生变化的基因克隆、测序及同源性分析。结果对等量的食道鳞状上皮细胞癌组织与癌旁正常黏膜组织cDNA进行消减杂交后,获得4个与食道癌发生与转移有关的序列标签,经测序和同源性检索证实为食道癌相关基因2、胱抑素B、膜联蛋白A1、钙粒蛋白A,它们的表达变化可能与食道癌的去分化、恶性增殖转化有关。结论抑制性消减杂交技术可高通量地分析食道癌发生、发展和转移过程中基因表达的变化。     

慢病毒介导的RNA干扰体外抑制HBeAg表达的实验研究

目的为防治HBV感染的新措施提供实验依据。方法针对HBV prec/c基因序列,构建shRNA表达载体psiHBV1、psiHBV2和无关序列psiHBVc。psiHBV与慢病毒辅助质粒系统共转染293T细胞组装慢病毒颗粒后,感染HepG2 2.15细胞,微粒子化学发光分析仪(MEIA)检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达;用定量PCR检测prec/c mRNA的转录情况。结果重组质粒双酶切和测序鉴定与预期结果相符合;组装慢病毒颗粒感染HepG2 2.15细胞后,prec/c mRNA转录降低;与对照组比较,HBeAg的表达水平也显著降低,病毒颗粒对HBeAg表达的抑制作用差异有统计学意义(P<0.01)。结论 RNAi能特异性抑制HBV表达,为应用RNA干扰技术进行乙型肝炎的治疗奠定了基础。     

川北地区胃癌特异性表达基因的克隆

目的：构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,筛选胃癌特异表达基因。方法：取胃低分化腺癌组织和癌旁正常黏膜组织,提取总RNA,逆转录cDNA,进行SSH构建消减文库获得序列标签,与载体连接、克隆、筛选、测序及同源性检索。结果：以癌旁正常黏膜组织为driver、胃低分化腺癌组织为tester成功构建cDNA消减文库,测序结果与公共数据库中已知基因和人类EST比较,获得5个特异性序列标签（NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR）。结论：应用SSH法成功构建胃低分化腺癌组织cDNA消减文库,初步筛选胃癌部分表达基因,为寻找川北地区胃癌发生发展的特异性基因奠定基础。     

EPEC粘附相关蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建与EPEC粘附相关蛋白IntiminC300、EspA、BfpA融合表达载体,并进行表达。方法用PCR方法从EPEC染色体中调取intiminC300、espA、bfpA基因,用基因重组的方法把3个基因片段用2个(Gly4Ser)3连接肽串联克隆到载体pQE30的多克隆区,转化宿主菌M15,用IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达的融合蛋白。结果酶切和测序表明成功构建了融合表达载体,SDS-PAGE检测表达蛋白的分子质量单位分别为36、43和76kd,与理论值相符,Western blot显示表达的融合蛋白均能被抗His标签抗体识别。结论本研究成功构建了EPEC粘附相关融合蛋白表达载体,并表达目的蛋白,为进一步研究融合蛋白的免疫原性奠定了基础。     

南充地区不同叶型半夏的指纹图谱分析

目的:比较南充地区野生芍药叶型和竹叶型半夏的指纹图谱并鉴定差异分子。方法:采用RAPD扩增、分析不同叶型半夏指纹图谱,并对典型特异扩增条带进行克隆和测序分析。结果:36条随机引物中有22条扩增出清晰条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增出157条带,竹叶型半夏基因组DNA扩增出161条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增的差异带3条,竹叶型半夏基因组DNA扩增的差异带7条。差异条带AOPN-14300经克隆测序证实为非编码区序列,Genbank登记号为EF417577。结论:南充野生不同叶型半夏基因组存在差异,已将部分典型差异基因组DNA片段进行克隆,为从分子水平鉴别本地区半夏奠定基础。     

紫外线作用肿瘤细胞后基因表达谱的变化

目的分析紫外线(UV)对人原发性肝癌细胞株基因表达谱的影响。方法以限制片段差异显示聚合酶链反应(RFDD-PCR)技术分析紫外线照射人原发性肝癌细胞株前后基因表达谱的变化。结果获得表达序列标签共257条。其中差异表达序列标签116条,含开启表达序列标签38条,关闭表达序列标签23条,表达增强序列标签40条,表达降低序列标签15条。结论紫外线可引起人原发性肝癌细胞株基因表达谱发生变化,这些表达发生变化的基因在肿瘤生物学中的作用有待进一步研究。     

南充野生半夏遗传关系RAPD分析

目的比较南充野生芍药叶型、竹叶型半夏的遗传关系。方法使用22条随机引物,对上述两种叶型半夏基因组DNA进行RAPD扩增,比较它们的差异条带。利用Nei,Li方法计算两种半夏之间的遗传相似系数和遗传距离指数。结果22条引物可对南充野生芍药叶型、竹叶型半夏扩增出清晰条带。芍药叶型半夏基因组DNA扩增出157条带,竹叶型半夏基因组DNA扩增出161条带,芍药叶型半夏基因组DNA扩增的差异带3条,竹叶型半夏基因组DNA扩增的差异带7条。它们的遗传相似系数为0.9686;遗传距离指数为0.0314。结论利用RAPD技术证实了野生芍药叶型、竹叶型半夏的遗传关系存在差异,为进一步利用该技术进行半夏分类鉴定等研究奠定了基础。     

靶向HBVs和e抗原基因的shRNA表达载体共转染对HBV抗原表达的抑制作用

目的:探索靶向乙型肝炎病毒HBsAg基因的shR-NA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3及靶向HBeAg基因shRNA表达载体psiHBV4、psiHBV5、psiHBV6共转染,对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV抗原表达的抑制作用。方法:以质粒PTZ为阴性对照,将自行构建的靶向HBVs和e抗原基因的shRNA表达载体按不同组合共转染HepG-2.2.15细胞;继续培养24 h后用MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果:psiHBV4+PgS2、psiH-BV4+PgS3在联合转染时,在细胞上清和裂解液中对HBsAg和HBeAg表达都有显著抑制作用(P0.05),psiHBV5+PgS1、psiHBV6+PgS3对裂解液HBeAg表达抑制作用不显著(P0.05)。结论:靶向HBs和HBe基因的两种载体psiH-BV4+PgS2、psiHBV4+PgS3共转染比单个载体转染更能显著减少HBV抗原的表达。     

小鼠B7-H4慢病毒表达载体的构建及对脾细胞增殖的影响

目的:构建小鼠B7-H4(mB7-H4)慢病毒表达载体并观察B7-H4蛋白对脾细胞增殖的影响。方法:从BALB/c小鼠肺脏中克隆B7-H4基因,构建表达载体mB7-H4-EGFP,酶切后克隆入慢病毒表达载体pCDH1-MCS1-EF1-Puro中,命名为pCDH1-mB7-H4-EGFP;以包含起始密码和多克隆位点的寡核苷酸取代mB7-H4作为对照载体pCDH1-Control-EGFP。分别与包装载体混合物一起经LipofectamineTM2000转染入293T细胞包装成病毒颗粒,感染293T细胞。pCDH1-mB7-H4-EGFP重组慢病毒感染的293T细胞分别与BALB/c、C57BL/6、BALB/c∶C57BL/6(1∶1)小鼠脾细胞混合培养,用MTT法检测其对脾细胞增殖的影响,对照为pCDH1-Con-trol-EGFP重组慢病毒感染的293T细胞进行的相同处理。结果:mB7-H4被成功克隆,测序证实与GenBank的mRNA核酸序列2个核苷酸有差异,但与其编码的氨基酸一致。pCDH1-mB7-H4-EGFP慢病毒表达载体被成功构建。mB7-H4蛋白表达在293T细胞表面,与对照相比,对BALB/c、C57BL/6、BALB/c∶C57BL/6(1∶1)小鼠脾细胞增殖均具有明显抑制作用。结论:成功构建小鼠B7-H4慢病毒表达载体,感染293T细胞后表达出对脾细胞增殖具有抑制活性的mB7-H4膜表面蛋白。