广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DVI)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析．了解各流行株之间的遗传差异，追踪其可能的传染来源：方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因，克隆到PMD18-T载体．转化JM109宿主菌，挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定，应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析．并绘制基因系统发生树：结果3株DVI病毒E基因序列长度均为l485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性在91％～98％之间、推测的氨基酸序列同源性在94％～99％之间：GD23／95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95％(98％)，与其他株的同源性相对较低，2株属同一基因型；GD14／97和GD05／99与Cambodia共享序列非常接近．3株同属另一基因型。结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地。     

2002年广东省H3N2亚型流感病毒流行的分子基础

目的 了解广东省2002年H3N2亚型流感病毒流行及抗原性变异情况。方法 用狗肾传代细胞(MDCK)和鸡胚进行流感病毒分离，用交叉血凝抑制实验对毒株进行抗原性分析；提取病毒RNA，用一步法RT-PCR扩增血凝素基因(H3A)，产物纯化后，并将其克隆到pMD18—T Vector，进行序列测定和分析。结果 2002年1-10月共获得流感病毒246株，其中H3N2亚型210株，占85．4％，H1N1亚型2株，占0．8％，B型34株，占13．8％；2002年流感流行的高峰是6月；抗原性分析显示，2002年广东省H3N2亚型流感病毒A／粤/236/2002和2001年流行株A／粤／448／2001以及目前国内代表株A／闽／151／2001的抗原比分别是5．6和4．0；其HAl区氨基酸序列和国际代表株A／悉尼／5／97同源性为94．2％，有19个氨基酸差异，其中发生在抗原决定族A、B、E上的有6个，受体结合部有3个。结论 2002年广东省流感病毒以H3N2亚型为主，其流行的分子基础是基因变异导致抗原性发生漂移。     

河北省2002～2004年流行期甲3亚型流行性感冒毒株HA1基因特性分析

目的 了解河北省2002—2004年两个流行期甲，（H3N2）亚型流行性感冒（流感）病毒株血凝素（HA）基因的特性。方法 随机抽取两个流行期分离到的4株甲3亚型流感病毒株，提取病毒核糖核酸（RNA），采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增病毒HA1基因纯化产物进行核苷酸序列测定，并用DNASTAR软件进行处理。结果 河北省2002-2004年两个流行期共分离到流感毒株92株，甲3亚型流感毒株76株，乙型毒株16株；新分离毒株与2002—2003年国内外分离到的甲3亚型毒株同源性接近，甲3亚型流感病毒活动增强并成为优势株是由于HA1基因发生突变所造成的。结论 河北省2002-2004年分离到的4株病毒与A／Johannesbur／64／03属于同一种系，属于两个小分支。     

湖南狂犬病毒P基因和M基因分子遗传特征

目的了解湖南省狂犬病毒的分子流行病学特征以及其与疫苗株的差异。方法对4株湖南狂犬病病毒P和M基因同时进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果同源性分析表明，4株湖南街毒P和M基因核苷酸同源性分别为97．3％-99．4％和98．4％-99．8％；与其它I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸同源性比较，P基因分别为78．4％-90．2％和81．8％-86．8％；M基因的分别为81．8％-92．1％和84．7％-90．6％。4株野毒P和M基因氨基酸同源性分别为98．0％-99．3％和98．5％-99．0％。结论4株病毒P基因和M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与我国现用的人用及兽用疫苗株存在一定差异。进化关系表明，4株病毒均为基因I型狂犬病毒；与我国宁夏分离株最近；与其它I型毒株分离自菲律宾和泰国等东南亚的毒株亲缘关系较近；而与翼手目的毒株关系最远。     

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。     

郴州市2005年流行性感冒监测分析

目的 对郴州市2005年流行性感冒（流感）的流行病学和病原学监测结果分析。方法对市区两所医院逐月统计流感样病例（ILI），采集ILI咽拭子样本用狗肾传代细胞进行流感病毒分离，以血凝抑制方法（HI）进行流感病毒型别鉴定。结果 两所医院全年报告流感样病例2570例，其中〈15岁的ILI占76．03％，≥15岁的ILI占23．97％，2005年4—12月共检测ILI咽拭子样本140份，分离出流感病毒19株，5株因HA〈1：20未能鉴定，14株鉴定结果为A（H3N2）亚型8株，A（H1N1）亚型1株，B型5株。结论 郴州市2005年监测点和爆发疫情流感样病毒分离阳性率为13．57％，A（H3N2）为流行优势毒株，同时也有A（H1N1）亚型和B型毒株存在。     

唐山市流行性腮腺炎病毒小疏水蛋白基因序列分析

目的 探讨唐山市流行性腮腺炎病毒的分子特征。方法 收集唐山市不同行政区的流行性腮腺炎患儿唾液标本5份，其中，爆发病例2例，散发病例3例。经RT-PCR扩增小疏水蛋白（SH）基因并测序，利用Clustal X软件进行系统发育分析。结果 唐山市分离的5株流行性腮腺炎病毒均为F亚型。各株病毒SH基因的核苷酸序列一致率为94．8％～100．0％，氨基酸序列一致率为91．4％～100.0％，但与国内主要野毒株SH基因的氨基酸序列一致率只有80．7％。系统发育分析显示，唐山市的各样本之间同源性较高．其次是国内的野毒株。而与国外野毒株及疫苗株同源性低。结论 唐山市存在多种流行性腮腺炎病毒株流行，主要基因型为F亚刑。     

重庆市2009～2014年甲型 H1N1流感病毒分离株 HA基因变异分析

目的：对2009～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行血凝素（HA）基因测序分析,与世界卫生组织（WHO）推荐疫苗株A／California／07／2009（H1N1）比对,研究其基因变异情况。方法按分离时间及地点不同,选取47株2011～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行测序,同时选取既往已有的25株2009年甲型H1N1流感病毒的序列结果,经分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树。结果2009、2011～2014年的新型甲型 H1N1流感病毒与疫苗株均位于一个大的分枝下,各病毒间的关系均较近。72株分离株的 H A基因总的核苷酸差异在0～2．7％之间,氨基酸差异在0～3．1％之间;与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）的核苷酸差异在0．4％～2．4％之间,氨基酸差异在0．9％～3．1％之间。氨基酸变异情况随着年份增加累积得更多,但在氨基酸序列上仍显示为低致病性流感病毒特征;2009年有9株病毒株丢失481位的糖基化位点,2013年有6株病毒株增加位于162位的糖基化位点。结论 WHO推荐的甲型 H1N1疫苗总体上对重庆地区的人群仍有较好的保护作用,但随着时间推移,部分甲型 H1N1流感病毒株可能已发生抗原漂移,需继续对其监测。     

深圳市一起急性出血性结膜炎爆发的分子特征分析

目的快速检测深圳市2007年一起急性出血性结膜炎爆发流行的病原并分析其基因进化。方法采集8例疑似急性出血性结膜炎患者的眼拭子标本,提取病毒核酸。用三套可能引起急性出血性结膜炎的病原体的特异性引物进行PCR反应,根据扩增产物琼脂糖凝胶电泳所产生的目的条带快速判定病原体类型。将扩增产物测序后,与不同地区、不同时期相应病原体的毒株进行同源性比较和进化树分析。结果在8例疑似急性出血性结膜炎患者中检测出5例柯萨奇病毒A24型变异株阳性,阳性率为62.5%。基因进化分析显示这5株柯萨奇病毒A24型变异株的VP4序列的组内核苷酸同源性为100%,与同时期广东省流行的CA24v毒株的VP4序列亲缘关系最近,核苷酸同源性为100%;与柯萨奇病毒A24型变异株原型株EH24/70的核苷酸同源性为84.5%;与柯萨奇病毒A24原型株Jospeh的核苷酸同源性为76.3%。结论本次急性出血性结膜炎爆发流行的病原体是柯萨奇病毒A24型变异株,毒株可能来源于同时期广东省流行的株型。     

新疆2011-2013年肠道病毒71型VP1区基因特征分析简

目的了解新疆肠道病毒71型（EV71）分离株VP1区基因特征。方法选取2011-2013年新疆部分地州手足口病病例标本,临床标本或其病毒培养物经实时荧光PCR鉴定后,通过RT—PCR法进行VP1区编码基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,所得序列用ChromasPro1．7．4,BioEdit7．1．11和MEGA5．1软件进行序列校正、拼接、整理和分析,并与EV71各型及亚型参考序列构建基于VPl序列的系统进化树。结果新疆EV71分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性在92．8％～100．0％和97．9％～100．0％,22株病毒株与安徽阜阳和山东临沂C4a基因参考株最为相近,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在93．9％～98．6％和98．6％～99．6％。而与A、B基因型参考株差异较大,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在82．1％～84．8％和95．9％～98．3％。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定的阳性率为30．0％,低于用病毒培养物的阳性率（100．0％）。结论2011—2013年新疆EV71分离株均为C4a基因型,与安徽和山东分离的EV71毒株可能有相同的起源。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定可用于肠道病毒的分型鉴定。     

2010年青海省流感病毒病原学监测及H3亚型HA1基因序列分析

目的监测青海省2010年季节性流感病毒型与亚型分布,并了解2010年部分A/H3N2分离株血凝素(HA)基因变异情况。方法采集全省各监测哨点医院鼻咽双拭子标本,接种MDCK细胞,采用标准抗血清鉴定阳性分离株型与亚型,并对2010年部分H3亚型流感病毒进行HA基因测序,分析HA基因变异情况。结果2010年全省哨点医院送检标本中共分离63株流感病毒,其中42株为A/H3N2,B型15株,AH1N1流感病毒6株,型与亚型有明显分布强弱特征。选取10株H3N2亚型分离株进行HA序列分析,发现与同期南京分离株接近,与WHO2010年度疫苗推荐株相距甚远,不在同一分支。结论 2010年青海省流行的H3N2亚型流感病毒的抗原性和基因特性发生了改变。     

广州市一起水禽H5N1疫情禽流感病毒血凝素基因分析

目的了解广州市一起水禽H5N1疫情中高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(HA)基因的特点以及与其他毒株序列间的关系。方法自疫点采集97份咽拭子标本及84份环境拭子标本,实时荧光RT-PCR检测H5核酸,从阳性标本中扩增全长HA基因并作序列测定,同2006年广州市及国内其他地区报道的人禽流感病毒HA基因进行比较并作系统发生分析。结果从一份环境拭子中扩增获得一株H5N1禽流感病毒HA基因,系统发生树分析发现与广州市2006年人禽流感病毒HA序列一致性较高,且与国内其他地区报道的H5N1病毒HA基因属于同一组;从基因序列推导出HA的氨基酸序列,发现其受体特异性为禽源的,蛋白酶水解位点含有多个连续的碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒的特征。结论引发此次禽间禽流感的为高致病性H5N1病毒,和广州市人禽流感的H5N1病毒在遗传上有紧密的亲缘关系。禽源性的H5N1病毒仍存在感染人类的可能性,禽类从业人员目前处于感染高致病性禽流感的高危状态,进一步加强对活禽市场和禽类从业人员的监测,对于预防禽流感的流行具有重要意义。     

Characterization of hemagglutinin gene of influenza A virus subtype H9N2

Objective　To determine the origin of human influenza A (H9N2) virus and the relationship among H9N2 strains isolated from different hosts, on the basis of molecular biology. Methods　Viruses were passed in embryonated hen eggs, and virion RNA was extracted from allantoic fluid and reverse transcribed to synthesize cDNA. cDNA was amplified by PCR and the PCR product was purified with a purification kit. Afterwards RNA sequence analysis was performed by dideoxynucleotide chain termination and a cloning method. Finally, phylogenetic analysis of the sequencing data was performed with MegAlign (version 1.03) and Editseg (version 3.69) softwares. Results　The amino acid sequences at the cleavage site between HA1 and HA2 domains of H9N2 viruses isolated in China are R-S-S-R. One pigeon strain contains seven potential glycosylation sites on the HA protein molecule, while all others have eight. There are 2 to 15 differences of amino acid sequences distributed at 24 different positions on the HA protein molecules among six H9N2 viruses. The H9N2 viruses with multiple lineages of HA genes were co-circulating in China recently. Conclusion　The highest possibility is that human influenza A (H9N2) virus was derived from Chicken H9N2 virus, and not derived from pigeon H9N2 virus. However, it is still unknown whether the H9N2 virus could transmit from person to person. The H9N2 viruses with multiple lineages of HA genes are co-circulating in China.     

甲型流感病毒H9N2亚型毒株血凝素基因特性的研究

目的　了解人甲型流感病毒H9N2亚型毒株的来源及从分子生物学角度来弄清不同宿主来源的H9N2亚型毒株间相互关系。方法　病毒在鸡胚中传代 ,从收获的尿囊液中提取病毒粒RNA ,通过逆转录合成cDNA。cDNA通过PCR进行扩增 ,接着PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。而后 ,RNA序列测定是采用双脱氧链末端终止和克隆法。最后用MegAlign( 1.0 3版 )和Editseq( 3.69版 )软件进行种系发生学分析。结果　从中国所分离出的H9N2亚型毒株。它们的HA1与HA2间裂解部位的氨基酸序列均为R S S R ,除一株鸽病毒其HA蛋白分子上仅含 7个潜在的糖基化位点外 ,而其余的均含 8个。 6株H9N2毒株HA蛋白分子上氨基酸序列有 2 - 16个不同 ,这些不同分布在 2 4个不同的位点上。近来在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2亚型毒株。结论　人甲型流感病毒H9N2亚型毒株可能性最大来自鸡的H9N2毒株 ,而不是来源于鸽的H9N2毒株。但 ,H9N2毒株是否具有人传人能力 ,至今仍不清楚。在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2毒株。     

全国流感监测网络宁夏监测点2004-2005年度流行性感冒监测结果分析

目的了解宁夏监测地区2004-2005年度流行性感冒(流感)流行情况和病毒流行株及其构成。方法每周统计监测点流感样病例(ILI),采集ILI咽拭子标本,用鸡胚和狗肾传代细胞进行流感病毒分离,采用血凝抑制试验(HI)进行流感病毒型别鉴定。结果两所监测医院共统计上报流感样病例289例,采集ILI标本220份,分离出流感病毒26株,其中H1N1、H3N2和B型流感病毒分别为14株、6株和6株。结论2004-2005年度宁夏流感监测地区的流行情况较为平静,流行优势株为H1N1亚型流感病毒。     

2005～2006年宁波市甲1亚型流感病毒的病原学及基因特性分析

目的 了解2005～2006年宁波市流行的甲型流行性感冒病毒A(H1N1)亚型的病原学分子生物学特性.方法 将2005～2006年分离的流感病毒进行血清学分型,挑选H1N1亚型流感病毒的代表株进行血凝素基因(HA1)片断的核苷酸序列测定,分析抗原变异情况.结果 H1N1亚型在2005年3月起在宁波市开始活动加强,同年9月起逐渐形成优势成为主要的流行株.病毒核苷酸序列测定结果,2005年3～4月流行的H1N1与9月以后流行的H1N1氨基酸序列有较大的差异,两者为不同性状的毒株.而且后者的氨基酸序列在2006年又进一步发生了变异,与当前疫苗株A/New caledonia/20/1999的抗原性差异进一步加大.同源性降至96.3%.结论 H1N1亚型流感病毒重新引起流行并成为优势株与其抗原性的变异及人群中针对这一病毒的免疫力下降有关.     

宁波市麻疹野毒株N基因片段研究

目的探讨宁波市麻疹流行株的基因型别和遗传特征。方法利用细胞培养从宁波市2004~2005年28例临床诊断麻疹病例的咽拭子中分离麻疹病毒,通过RT-PCR扩增出病毒核蛋白(N)基因C末端456bp片段进行测序,并分析其和GenBank中麻疹病毒各基因型代表株的同源性。结果分离到8株麻疹病毒,其N基因片段与H1型代表株Hunan.CHN的同源性为97.6%~98.5%,与麻苗Shanghai-191的同源性为92.8%~93.4%。结论宁波市麻疹流行株属于H1基因型。     

福州市甲型H1N1流感病毒血凝素基因遗传特性研究

目的探究福州市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因的遗传变异特点及种系进化分布,为研究甲型H1N1流感病毒进化、致病性和流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞培养法和real-time PCR法进行流感病毒分离、鉴定。采用逆转录-聚合酶链反应扩增流感病毒血凝素基因,扩增产物经纯化后,进行血凝素基因HA区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后用DNASTAR MegAlign序列分析软件进行基因种系进化特性分析。结果福州市甲型H1N1流感病毒与参考株A/California/04/2009相比具有高度同源性,HA蛋白有4个位点氨基酸发生了替换,与猪流感代表株A/swine/Iowa/15/1930(H1N1)存在6个HA抗原决定簇位点变异。福州市甲型H1N1流感病毒株都有8个糖基化位点,其中6个位于HA1区,分离株HA蛋白不具有多碱基裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与美国流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株共聚类为一个独立的小分支,进化关系最近,甲型H1N1流感病毒的HA源于古典型猪H1N1流感病毒,与A/swine/Iowa/1/1976(H1...     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲（A）型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系。方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列。结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976~2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低。不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感。     

2000～2009年H1N1甲型流感病毒血凝素基因HA1的演变特征

目的研究2000～2009年世界各地不同物种的新型H1N1流感病毒HA1基因演变特征。方法从NCBI数据库下载所需序列,采用生物信息软件对其氨基酸序列进行基因特性分析以及构建种系发生树。结果病毒株HA1基因抗原决定簇和多个受体结合位点发生变异,并且新型病毒与猪H1N1流感病毒在大多数变异位点的氨基酸相同。结论新型毒株HA1基因可能由早期来自北美洲的H1N1猪流感病毒进化而来,在进化过程中,一些重要位点的变异导致HA1基因发生抗原性变异,从而导致流感的大爆发。