Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建Has-mir-196b慢病毒表达载体并对其进行鉴定.方法 以正常人外周血DNA为模板,PCR扩增得到目的基因.通过却Hpa I/Xho I双酶切及其后的连接将其插入Lentilox 3.7(pLL-3.7)质粒中.PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用pLL-3.7-mir-196b、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒系统共感染HEK-293FT细胞,包装生产慢病毒.将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以检测病毒滴度,并用实时定量PCR检测慢病毒感染后Has-mir-196b的表达变化.结果 PCR及测序结果证明成功构建了pLL-3.7-mir-196b重组质粒.所得慢病毒上清滴度为(7.2±101)×107TU/ml.感染慢病毒的239FT细胞中,Has-mir-196b的表达量相对于未感染细胞提高了约24倍.结论 成功构建Has-mir-196b慢病毒表达载体.     

2011年湖南省某些地区流行性腮腺炎病毒基因特性分析

目的 了解湖南地区流行性腮腺炎(流腮)病毒流行株基因特性及变异情况.方法 采用Vero/SLAM细胞分离流行性腮腺炎病毒,通过小疏水蛋白基因(SH基因)的序列分析,与其他基因型参考株进行同源性比较,构建亲缘进化树.结果 从2011年湖南多地区上送的16份咽拭子标本中分离到腮腺炎病毒4株,通过基因特性分析,4株毒株均属于F基因型.结论 2011年湖南省流行性腮腺炎的流行株为F基因型,未发现基因型变异.     

hsa-miR-30e的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆hsa-miR-30e并构建其慢病毒表达载体.方法 PCR扩增hsa-miR-30e的前体序列,克隆于慢病毒载体pll3-7,转染包装细胞293FT细胞.收获病毒颗粒,荧光定量PCR检测hsa-miR-30e的表达.结果 经双酶切及测序鉴定,hsa-miR-30e的慢病毒表达载体构建成功,倒置荧光显微镜下观察转染后293FT细胞发出绿色荧光.结论 成功构建hsa-miR-30e的慢病毒表达载体,为进一步研究hsa-miR-30e的生物学功能奠定了基础.     

长沙市4例输入新型冠状病毒Omicron变异株全基因组序列特征分析

目的 分析长沙市境外输入新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的全基因组序列特征以及遗传变异情况。方法 采用高通量测序方法对2021年12月的SARS-CoV-2进行全基因组序测序,序列进行比对以及进化分析。结果 本研究获得4株SARS-CoV-2全基因组序列,长度为29 685 bp。毒株核苷酸序列与Wuhan-Hu-1参考株(EPI_ISL_402125)相比,同源性为99.6%。与Omicron变异株(EPI_ISL_8890653)相比,同源性为99.9%。进化树分析表明毒株序列位于BA.1.1分支,与SARS-CoV-2 Omicron变异株位于同一分支。氨基酸序列位点分析发现毒株具有典型的Omicron序列突变位点。ORF1ab区域发现G5494S,K4346R,T5035I和E6945D突变。S蛋白抗体结合区域发生R346K突变。结论 长沙市输入的Omicron变异株携带已报道可明确导致病毒传播和致病力发生变化的突变位点,应继续加强疫情应对措施。     

2000-2009年H1N1甲型流感病毒神经氨酸酶的进化分析和序列解析

目的研究2000-2009年世界各地不同物种流感病毒神经氨酸酶的进化特征和关键位点的变异情况。结论从NCBI数据库下载所需序列,采用生物信息软件对其氨基酸序列进行种系发生树的构建,以及序列特性的分析。结果新型流感病毒和猪/禽流感病毒NA蛋白在进化关系上非常接近,并且抗原决定簇和糖基化位点的变异也大致相同。结论新型毒株NA蛋白可能由早期的H1N1猪/禽流感病毒进化而来,在进化过程中,一些重要位点的变异导致NA蛋白发生抗原性变异,从而导致流感的大爆发。     

Hsa-mir-196b慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体并对其进行鉴定。方法以正常人外周血DNA为模板,PCR扩增得到目的基因。通过HpaⅠ/XhoⅠ双酶切及其后的连接将其插入Lentilox3.7（pLL-3.7）质粒中。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLL-3.7-mir-196b、pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91三质粒系统共感染HEK-293FT细胞,包装生产慢病毒。将所得病毒悬液梯度稀释后感染HEK293FT细胞,以检测病毒滴度,并用实时定量PCR检测慢病毒感染后Hsa-mir-196b的表达变化。结果 PCR及测序结果证明成功构建了pLL-3.7-mir-196b重组质粒。所得慢病毒上清滴度为（7.2±1.1）×107TU/ml。感染慢病毒的239FT细胞中,Hsa-mir-196b的表达量相对于未感染细胞提高了约24倍。结论成功构建Hsa-mir-196b慢病毒表达载体。     

hsa—miR-30e的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆hsa—miR-30e并构建其慢病毒表达载体。方法PCR扩增hsa—miR-30e的前体序列,克隆于慢病毒载体p113．7,转染包装细胞293FT细胞,收获病毒颗粒,荧光定量PCR检测hsa—miR-30e的表达。结果经双酶切及测序鉴定,hsa—miR-30e的慢病毒表达载体构建成功,倒置荧光显微镜下观察转染后293FT细胞发出绿色荧光。结论成功构建hsa—miR-30e的慢病毒表达载体,为进一步研究hsa-miR-30e的生物学功能奠定了基础。     

2000-2009年H1N1甲型流感病毒神经氨酸酶的进化分析和序列解析

目的研究2000-2009年世界各地不同物种流感病毒神经氨酸酶的进化特征和关键位点的变异情况。结论从NCBI数据库下载所需序列,采用生物信息软件对其氨基酸序列进行种系发生树的构建,以及序列特性的分析。结果新型流感病毒和猪/禽流感病毒NA蛋白在进化关系上非常接近,并且抗原决定簇和糖基化位点的变异也大致相同。结论新型毒株NA蛋白可能由早期的H1N1猪/禽流感病毒进化而来,在进化过程中,一些重要位点的变异导致NA蛋白发生抗原性变异,从而导致流感的大爆发。     

湖南省首例猪链球菌14型人源分离株鉴定及毒力基因分析

目的 了解湖南省首例猪链球菌14型菌株的生物学性状及病原学特征。方法 采集患者的关节液接种到血琼脂平板,进行猪链球菌的分离培养,通过镜检、生化和血清凝集试验确认后,用聚合酶链反应(PCR)检测猪链球菌种特异性基因(16S rRNA)、2型荚膜多糖基因(cps2J)、14型荚膜多糖基因(cps14J)以及相关毒力基因:溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、溶血素(sly)、纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)、胞外因子(ef)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、毒力相关序列orf2基因(orf2)和甘油醛一3一磷酸脱氢酶的编码基因(gapdh)。结果 患者的关节液中分离到猪链球菌14型菌株,种特异性基因16S rRNA阳性,荚膜多糖基因cps2J阴性、cps14J阳性,毒力基因mrp阴性,其余sly、fbps、ef、gdh、orf2、gapdh均为阳性。结论 湖南省已经出现了猪链球菌14型的流行,并携带多种毒力基因,需密切关注其流行趋势。