北京市1株人狂犬病病毒分离鉴定及其分子特征

目的研究北京市一株人狂犬病病毒的N、G基因的分子特征,比较与全国流行株以及疫苗株之间的差异。方法以直接免疫荧光技术检测病人脑组织,昆明乳鼠颅内接种法分离病毒株。以RT-PCR方法扩增病毒的核蛋白及糖蛋白基因,克隆测序后进行遗传学分析。结果直接免疫荧光检测到病人脑组织中的病毒颗粒,用乳鼠颅内接种法分离到了毒株。命名为Beijing（H）株。遗传分析表明Beijing（H）株与目前我国的主要流行株N基因和G基因的核苷酸序列同源性分别是97．6％～99．1％和97．5％～99．7％。推导的氨基酸序列同源性分别是97．6％-99．2％和97．7％-99.8％。结论Beijing（H）株为基因1型狂犬病毒,属于我国目前的流行株,其与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异。     

安徽省阜阳市狂犬病街毒株G基因序列分析

目的了解安徽省阜阳市流行的狂犬病毒株与人用、兽用狂犬病疫苗株在G基因核苷酸和氨基酸水平的差异,为有效控制我国狂犬病疫情提供初步科学依据。方法在安徽省阜阳市收集犬脑组织162份,用酶联免疫吸附试验（ELISA）和小鼠颅内接种试验（MIT）检测样品带毒情况,对阳性样品用RT—PCR扩增G基因并测序,以TOPALi和DNAStar软件对G基因序列进行分析。结果从安徽省阜阳市162份犬脑样品中检出阳性样品15份;这15株病毒与我国现在使用的各种疫苗株在G基因的核苷酸和氨基酸水平上均存在不同程度的变异,与我国人用疫苗株CTN同源性较高。结论15株狂犬病毒为基因Ⅰ型狂犬病毒,在核苷酸或氨基酸水平上,与疫苗株CTN之闻的同源性要高于与其它疫苗株之间的同源性。     

漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征分析

目的了解漳州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征。方法对2010年漳州市的5株肠道病毒71型分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4．0软件构建系统发生树。结果5株肠道病毒71型分离株的VP1区核苷酸序列全长均为891bp,且与2008年安徽阜阳流行株Fuyang．Anhui．P．R．C-17．08-2的VP1区核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高,分别为98．2％-98．8％和99．7％-100．0％。5株肠道病毒71型分离株间的核苷酸序列同源性为97．2％-99．8％．氨基酸序列同源性为99．3％～100．0％。氨基酸在98位和218位这两个位点发生了特异性变异。VP1区基因遗传进化分析表明,漳州市所有分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论5株肠道病毒71型分离株均属于C4基因亚型的C4a进化分支．与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型完全-致。     

兰州羔羊轮状病毒株VP4基因稳定性及基因结构分析

目的了解兰州羔羊轮状病毒（LLR）株VP4基因遗传变异特点及与人源性轮状病毒基因结构上的相关性,为疫苗的质量控制和对人体的免疫原性提供理论依据。方法严格按疫苗生产过程将LLR疫苗株毒种LLR38代在新生牛肾原代细胞传至第49代,取LLR38、LLR43、LLR44、LLR49代进行研究。通过逆转录-聚合酶链式反应获得了LLR株传代病毒VP4全基因的cDNA片段,构建成重组质粒,经酶切筛选,对克隆的VP4基因进行序列测定。结果LLR株VP4基因全长2362bp,编码776个氨基酸。各代次病毒的核苷酸和氨基酸遗传稳定,核苷酸同源性在99．7％-100．0％,氨基酸同源性在99．0％-100．0％。不同P基因型来源轮状病毒在亲缘关系上没有明显的区分。氨基酸序列比对分析显示,LLR株与13株人源病毒在基因结构上密切相关。结论LLR疫苗株vP4基因具有很好的遗传稳定性,LLR株毒种及生产的疫苗是安全有效的,能够预防轮状病毒感染。     

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。     

河南省9株狂犬病毒的N基因序列分析

 目的 分析河南省9株狂犬病毒的核蛋白基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性的可能变异。方法 以RT-nested-PCR扩增9株2006年12月分离于河南省信阳市的狂犬病毒街株,经纯化、克隆、测序后获得9条N基因全长序列,采用生物信息学软件对N基因序列进行分析。结果 9株狂犬病毒核蛋白在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为97.5%~99.3%和98.4%~99.8%;病毒与CTN疫苗的核苷酸序列同源性最高,为88.9%~90.1%,氨基酸序列同源性为97.6%~98.0%;与其他疫苗株相比,9株病毒与其核苷酸及氨基酸同源性范围分别为84.4%~87.9%和94.2%~97.3%;与已知的基因1型狂犬病毒比较,9株病毒核蛋白氨基酸序列发生了若干位点的取代。结论 9株河南省狂犬病毒流行株均属基因1型,其核蛋白在基因的核苷酸及推导的氨基酸水平上均有变异,这些变异可能影响疫苗对流行株所致狂犬病的保护效果。     

2004年宁波大学流感爆发病毒株的血凝素基因分析

目的了解宁波地区流行性感冒(流感)病毒株的变异情况。方法采集2004年5月宁波大学流感爆发期间病人的含漱液进行病毒分离、鉴定，并对其中1株病毒的血凝素重链区进行了核苷酸和氨基酸序列分析。结果在9份样品中共分离到流感病毒3株，经血清学试验鉴定为甲3型。与2002年宁波市流感病毒流行株的核苷酸同源性为98．2％-98．3％，氨基酸同源性为96．7％-97．3％；与2003年流行株的核苷酸同源性为98．7％，氨基酸同源性为97．6％；与参考株A／Sydney／05／1997的核苷酸同源性为95．9％，氨基酸同源性为92．7％；与参考株A／Wuhan／359／1995的核苷酸同源性为94．6％，氨基酸同源性为91．2％。结论2004年宁波大学流感爆发的病毒为甲3型。其HA1区序列更接近2003年流行毒株，与A／Sydney／05／1997毒株的同源性要高于A／Wuhan／359／1995。该爆发流行的毒株可能是在宁波以前流行毒株的基础上进化而来的。     

肾综合征出血热患者流产胎儿分离毒株84FLi的全基因序列分析

目的：克隆和测定汉滩病毒疫苗生产株84FLi的全基因组序列,了解其分子基础。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）,分节段扩增84FLi株L、M和S基因片段的cDNA,直接用PCR产物或克隆人pMD18-T载体后进行测序。结果：84FLi株L、M、S3个片段的全基因组序列为6533,3616和1688个核苷酸,分别编码2151,1135,429个氨基酸。A、C、G、T4种核苷酸分别为3830,2050,2510和3447个,GC含量为38．52％,AT含量为61．48％。序列同源性分析表明84FLi株与分离自广州的RG9株和分离自安徽的Chen4株高度同源。S片段核苷酸的同源性99．6％。与HTNV的国际标准毒株76－118的3个片段核苷酸同源性分别为83．7％、84．0％和87．2％,氨基酸同源性分别为97．5％、96．0％和97．9％。结论：84FLi株属于汉滩型病毒,并与分离自国内的汉滩病毒同源性较高,与中国株Chen4株和RG9株属于同一亚型。     

新疆2011-2013年肠道病毒71型VP1区基因特征分析简

目的了解新疆肠道病毒71型（EV71）分离株VP1区基因特征。方法选取2011-2013年新疆部分地州手足口病病例标本,临床标本或其病毒培养物经实时荧光PCR鉴定后,通过RT—PCR法进行VP1区编码基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,所得序列用ChromasPro1．7．4,BioEdit7．1．11和MEGA5．1软件进行序列校正、拼接、整理和分析,并与EV71各型及亚型参考序列构建基于VPl序列的系统进化树。结果新疆EV71分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性在92．8％～100．0％和97．9％～100．0％,22株病毒株与安徽阜阳和山东临沂C4a基因参考株最为相近,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在93．9％～98．6％和98．6％～99．6％。而与A、B基因型参考株差异较大,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在82．1％～84．8％和95．9％～98．3％。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定的阳性率为30．0％,低于用病毒培养物的阳性率（100．0％）。结论2011—2013年新疆EV71分离株均为C4a基因型,与安徽和山东分离的EV71毒株可能有相同的起源。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定可用于肠道病毒的分型鉴定。     

湖南省20株狂犬病毒株与疫苗株N基因序列分析

目的 分析湖南省狂犬病毒株与疫苗株的N基因序列及遗传进化关系,从基因角度解决疫苗的选择问题,为狂犬病的防治提供科学依据.方法 采用KT-PCK法从市售家犬脑组织标本内获得N基因并进行测序,采用DNAStar软件包中的MegAlign软件,将所得结果与国内外发表的代表性疫苗株相应基因进行核苷酸、氨基酸序列同源性比对分析,并以Neighbor-Joining法构建系统发生树.结果 湖南省20株狂犬病毒与国内外13株疫苗代表的株核苷酸同源性在85.3%～94.2%(中位数88.6%).相应地,N基因编码的氨基酸序列同源性为95.4%～99.6%(中位数99.2%).其中,与中国疫苗株CTN、SRV-9,国外疫苗株CVS、RBE3-15、SADB19-1st及HEP-Fllury株的氨基酸序列同源性范围在99.2%～99.6%,并以与CTN疫苗株同源性中位数最高(90%).系统发生分为两大群.湖南省20株研究毒株与中国人用CTN株具有很高的亲缘性,构成第一群.其余的疫苗毒株构成第二基因群.结论 湖南省狂犬病毒株与中国人用疫苗株CTN同源性最高、亲缘关系最近,因此在湖南省使用CTN疫苗株效果可能较好.     

海南省2019—2020监测年度A (H1N1) pdm09流感病毒基质蛋白基因特性分析

目的 分析2019—2020监测年度（2019年4月1日—2020年3月29日）海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒基质蛋白基因（Matrix, M）进化规律和M2蛋白氨基酸位点变异情况。方法 选取14株2019—2020年海南省分离的A (H1N1) pdm09亚型流感病毒进行基因序列测定,采用Neighbor-Joining方法进行种系进化分析,通过系统进化树比较海南流行株与疫苗株的差异。测序结果用MEGA 10.1.8和DNASTAR7.0.1软件进行基因特性分析及基因同源性分析。结果 2019—2020监测年度,海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒分离株占分离株的4.9%。序列分析显示,海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒与国际疫苗株A/Brisbane/02/2018的M基因在核苷酸系统进化树6B.1分支上,核苷酸与氨基酸同源性范围为98.7%~100.0%、98.8%~100.0%。12株分离株胞外区编码区S23N氨基酸发生变异;跨膜区14株分离株均发生S31N位点突变,突变率为100.0%;1株I39V位点氨基酸变异;9株分离株在胞浆区E70D位氨基酸位点发生变异。结论 2019—2020监测年度海南省A (H1N1) pdm09亚型流感病毒活动水平较低,与疫苗株相匹配,对金刚烷胺类药物耐药,应特别关注M2蛋白氨基酸变异情况,为临床抗流感病毒药物的使用提供科学依据。     

江苏省2012年柯萨奇病毒B组3型分离株全基因序列分析

目的探讨2012年江苏省手足口病（HFMD）患者临床样本中分离得到的3株柯萨奇病毒B组3型（CVB3）病毒的全基因序列特点。方法采集江苏省东海县和邳州市2012年HFMD患儿的咽拭子或肛拭子样本16份,经Vero细胞分离培养得到3株CVB3病毒,利用RT-PCR扩增CVB3全长基因。利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树,并对CVB3的毒力位点进行比较。结果扩增得到覆盖CVB3全基因组的3个片段,拼接后为CVB3全基因组,分别命名为DH09Y/JS/2012、DH16G/JS/2012和PZ23Y/JS/2012。同源性分析结果显示,该3株分离株之间同源性为87.6%~98.9%,与原型株（Nancy）的核苷酸同源性分别为80.5%、80.4%和81.2%。3个毒株均属于D2亚型。邳州市分离株和东海县2株毒株VP1区的同源性为91.8%~92.3%,分属于D2a和D2b两个不同分支。3株分离株除5′UTR的GUAA/GCAA模序和VP2的151位氨基酸外,其余毒力位点与近年引起心肌炎、无菌性脑膜炎等重症CVB3流行株一致。结论引起2012年江苏省HFMD的CVB3为D2亚型,不同地区流行D2a和D2b两个分支,此次分离株主要毒力位点与近年来CVB3流行株一致。     

Victoria系乙型流感病毒HA1基因变异特征分析

目的阐明2012年邯郸市分离的Victoria系乙型流感毒株HA1抗原性和基因变异特征。方法对2012-2013年分离的流感病毒采用RT-PCR方法特异性扩增HA1基因,扩增产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar中Megalign软件进行比对分析,构建系统进化树。结果邯郸市2012年分离的Victoria系乙型流感病毒与WHO推荐的2009-2012年北半球代表株相比,核苷酸同源性为98.1%-99.2%,氨基酸同源性为98.2%-99.4%。HA1区未发生氨基酸丢失和插入,与B/Brisbane/60/2008相比2个位点氨基酸替换具有共性（146I〉V和197D〉N）,而这2个位点与2006-2008年疫苗株B/Malaysia/2506/04相同。与B/Brisbane/60/2008相比7个毒株中有2个毒株发生了另外4个位点（58L〉P、129N〉S、171N〉D和174G〉E）的替换。结论 2012年邯郸市分离的Victoria系乙型流感病毒血凝素蛋白未发生明显的抗原性改变,与WHO推荐的2011-2012年的流感疫苗株B/Brisbane/60/2008匹配,不属于Victoria系乙型流感病毒新变种。     

广东省东莞市2017-2018年登革病毒E基因进化分析

目的 测定广东省东莞市2017—2018年Ⅰ~Ⅳ型登革病毒（DENV-1~DENV-4）的E基因序列,分析其系统进化情况及流行基因亚型,从分子水平探讨病毒来源。方法 收集东莞市2017—2018年140例可疑登革热患者急性期血清,用实时荧光PCR方法检测病毒核酸,阳性血清用C6/36细胞分离培养登革病毒,测定分离株E基因序列,绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果 140份急性期血清中DENV核酸阳性54份,阳性率38.6%,DENV-1阳性占53.7%。分离得到17株毒株。序列比对和系统进化分析显示,10株DENV-1分离株间核苷酸同源性为90.0%~99.9%,氨基酸同源性为96.6%~99.8%,分属基因Ⅰ型和基因Ⅴ型。7株基因Ⅰ型分离株与泰国2015年、缅甸2015年、中山2015年及越南2016年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.9%),其中2018年本地株D2018078与2017年输入株D2017008核苷酸同源性达99.8%;3株基因Ⅴ型分离株与印度2014年、2017年株及新加坡2014年流行株核苷酸同源性较高(97.7%~99.1%)。4株DENV-2分离株间核苷酸同源性为91.0%~98.6%,推导氨基酸同源性为97.6%~99.8%,分属混合型和亚洲Ⅰ型,2株混合型分离株与马来西亚2014年、台湾2015年流行株核苷酸同源性较高(99.6%~99.7%);2株亚洲Ⅰ型分离株分别与越南2015年、泰国2011年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.5%)。2株DENV-3分离株间核苷酸同源性为98.4%,氨基酸同源性为99.4%,均属基因Ⅰ型,与缅甸2017年、马来西亚2015年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.7%)。1株DENV-4分离株与越南2013、2016年流行株同源性较高(99.3%~99.5%),属基因Ⅰ型。结论 2017—2018年东莞市登革热的病原体主要为DENV-1,其次是DENV-2,各至少有2种基因亚型同时在流行;DENV-3和DENV-4各至少有1种基因亚型在流行。流行方式主要为南亚和东南亚国家及我国中山、台湾等地输入病例引起的本地暴发流行,存在输入引起本地感染的风险。     

宁夏2004-2007年流行麻疹野病毒基因特征分析

目的了解宁夏2004-2007年流行的麻疹野病毒分离株基因特征,为控制、消除麻疹提供科学依据。方法用B95a、Vero/Slam细胞从疑似麻疹暴发和散发患者的标本中分离麻疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从分离到的麻疹病毒中扩增出核蛋白(nucleoprotein,N)基因C末端676个核苷酸片段,再对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,并以C末端456个核苷酸片段构建基因亲缘性关系树,进行核苷酸、氨基酸同源性分析。结果分离的36株麻疹野病毒全部为H1基因型H1a亚型。36株麻疹野病毒的核苷酸同源性为96.2%-100.0%,氨基酸同源性为94.0%-100.0%。宁夏14株麻疹病毒代表株与中国S191疫苗株的核苷酸同源性为91.0%-92.5%,氨基酸同源性为85.4%-89.4%。结论宁夏2004-2007年流行的麻疹野病毒为H1基因型H1a亚型,未发现其它基因亚型。H1a基因亚型病毒株引起了多个传播链造成宁夏各市的麻疹流行。     

海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒血凝素基因特性

目的 了解海南省2019—2020年H3N2亚型流感病毒血凝素基因遗传进化规律与氨基酸变异情况。方法 选取2019—2020监测年度海南省5家流感监测网络实验室分离的16株H3N2亚型流感毒株进行一代全基因组测序,利用MEGA 10.1.8构建血凝素基因系统进化树,并分析氨基酸位点替换情况,应用DNA Star 7.0.1软件进行血凝素基因同源性分析。结果 系统进化树显示,相比于疫苗株A/Kansas/14/2017 (2019—2020）,16株H3N2亚型流感病毒分离株血凝素基因在进化树上与疫苗株A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016（2018—2019）亲缘关系更近,属于3C.2a1分支,核苷酸与氨基酸同源性范围分别为98.5%~98.9%、97.9%~98.4%。16株分离株在抗原性位点发生8处氨基酸位点替换,涉及5个抗原决定簇;15株分离株在糖基化位点发生2处缺失。结论 2019—2020年监测年度海南省H3N2亚型流感病毒与2018—2019年疫苗株亲缘关系较近,血凝素蛋白抗原性位点在5个决定簇均有变异,易造成较大流行,WHO 推荐的2019—2020年疫苗株保护效果可能不理想。应密切关注H3N2亚型流感病毒的流行与基因变异情况,为流感病毒疫苗株推荐及防控提供科学依据。     

东莞市2014—2017年Ⅰ型登革病毒流行情况及E基因序列分析

目的 研究2014—2017年东莞市Ⅰ型登革病毒（DENV-1）流行情况,分析其可能的地域来源及基因特征。方法 采用实时荧光PCR方法对2014—2017年东莞市疾病预防控制中心收到的登革热疫情样本进行核酸检测分型,阳性标本进行病毒分离及鉴定,扩增并测定部分分离株E基因序列,共得到8株DENV-1及其E基因序列,与Genebank中选取的世界各地DENV-1流行株及原型株进行参考对比,用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,用Mega4.0.2软件进行分子分型和系统进化树构建。结果 665份标本中DENV阳性251份,其中DENV-1阳性占90.0%。以9月、10月为发病高峰期,占86.7%;男女比例为0.92∶1,20~<70岁年龄组发病例数最多,占75.1%;DENV-1阳性本地病例以虎门、麻涌、南城、厚街和莞城五个镇街最多,占76.4%。序列比对显示,8株DENV-1的E基因序列核苷酸同源性为90.2%~99.6%,氨基酸同源性为96.4%~100.0%,与选取的近年世界各地流行株的核苷酸与氨基酸同源性分别为89.2%~100.0%和90.2%~100.0%。系统进化树分析显示,2014—2017年东莞8株DENV-1分离株与我国广州、深圳及新加坡、马来西亚等东南亚国家当年或往年DENV-1流行株同源性较高,分属基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型 ,但以基因Ⅰ、Ⅴ型为主。所有8株分离株与原型株进化距离较远。结论 2014—2017年东莞市登革病毒流行以DENV-1为主,流行基因亚型主要为基因Ⅰ型和基因Ⅴ型,流行方式为广深等周边地市及新加坡、马来西亚等东南亚各国输入病例引起的本地暴发流行。