端粒结合蛋白研究进展

端粒结合蛋白研究是近年来发展比较快的一个新的研究领域.自Chong在1995年发现人端粒重复序列结合因子TRF1后,近几年已发现了包括TRF2、TANK1、TANK2、TIN2、Pinx1、POT1等在内的10余种端粒结合蛋白.这些蛋白与端粒一起形成三维环状结构t-loop,其中端粒结合蛋白、端粒、端粒酶及其它参与细胞功能调控的重要蛋白相互作用,共同完成对DNA损伤修复、细胞周期、有丝分裂、细胞调亡等细胞基本生命活动的调节,与衰老和肿瘤有着密切的联系.展开和深入对该领域的研究,对了解衰老和肿瘤的根本机制,进一步寻求诊断和治疗的途径具有十分重要的意义.为此,就端粒结合蛋白在近几年的研究进展作一概述.     

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段（TRF1^33-277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF1^33-277，将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白哆，制备血清过柱纯化，将TRF1^33-277和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱，血清过GST柱以去除抗GST抗体，然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体，获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗。在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带，与阳对照基本一致。结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效。所获抗TRF1^33-277多克隆抗体为国内首次报道。     

TRF1 219位磷酸化在细胞周期调控中的作用研究

目的:研究端粒结合因子-1(TRF1)丝氨酸219位磷酸化对细胞周期的影响。方法:突变TRF1的219位氨基酸,构建模拟磷酸化和非磷酸化状态的突变体TRF1S219D-GFP和TRF1S219A-GFP,核苷酸测序和免疫印迹验证目的基因序列及蛋白表达。将野生型和突变体质粒用脂质体转染法转入H eLa细胞,观察它们在细胞中的定位、流式细胞仪检测各细胞周期的细胞数量、免疫印迹检测转染后ATM蛋白水平的改变。结果:测序证实突变成功,GFP抗体免疫印迹证实了突变体的蛋白表达。荧光显微镜下观察到TRF1S219A-GFP和TRF1S219D-GFP均呈点状定位于细胞端粒。流式细胞仪结果显示,过表达野生型和非磷酸化突变体的H eLa细胞产生G 2/M期的阻滞(P<0.05)。转染野生型和突变体后H eLa细胞中ATM蛋白含量均比对照组增高。结论:ATM激酶对TRF1丝氨酸219位的磷酸化可以抑制由于TRF1过量表达而引起的细胞周期G 2/M期的阻滞。     

泛素羧基末端水解酶L1 C90S和I93M点突变不影响小鼠卵母细胞成熟

目的 通过观察泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)点突变蛋白与野生型蛋白过量对小鼠卵母细胞成熟的影响,并分析其在小鼠卵母细胞离体成熟过程中的作用及作用方式.方法 通过原核重组蛋白技术制备UCHL1点突变(C90S和I93M)和野生型蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,通过显微注射技术将UCHL1野生型蛋白与GST的融合蛋白、UCHL1点突变蛋白与GST的融合蛋白、GST、PBS分别注射到小鼠未成熟卵母细胞,或在体外培养基中添加UCHL1野生型蛋白与GST的融合蛋白,分析野生型UCHL1过量、UCHL1(I93M)点突变蛋白添加及泛素水解酶活性缺失的UCHL1(C90S)点突变蛋白添加对卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率的影响.分离UCHL1(I93M)点突变小鼠与野生型小鼠的生发泡期卵母细胞,体外培养3 h后比较其GVBD率.结果 显微注射UCHL1野生型蛋白及其点突变体与GST的融合蛋白的各组之间、注射GST组、注射PBS组卵母细胞GVBD率差异均无统计学意义,在培养基中添加UCHL1蛋白与GST的融合蛋白组卵母细胞GVBD率与无注射无添加对照组相比差异也无统计学意义(P均>0.05).注射UCHL1(C90S)与GST的融合蛋白组有少量生发泡期卵母细胞体外发育为MⅡ期卵母细胞后呈现极体较对照组偏大的现象.UCHL1(I93M)点突变小鼠生发泡期卵母细胞体外GVBD率与野生型小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 在小鼠卵母细胞中添加外源性UCHL1、有致病作用的UCHL1(I93M)突变体或泛素水解酶活性丧失的UCHL1(C90S)突变体均不影响卵母细胞成熟的GVBD进程,UCHL1(I93M)点突变小鼠卵母细胞GVBD率亦无异常,但UCHL1(C90S)点突变可能影响极体的形成.     

端粒重复结合蛋白1与磷酸化激酶Aurora B相互作用研究

目的 鉴定端粒重复结合蛋白1(TRF1)的磷酸化位点及其与磷酸化激酶Aurora B在体内外的相互作用.方法 用myc-His-TRF1真核表达质粒转染人宫颈癌细胞HeLa,免疫沉淀后行质谱分析.采用免疫沉淀及体外沉降实验研究TRF1与Aurora B的相互作用.结果 免疫沉淀实验结合质谱分析鉴定出5个新的TRF1磷酸...     

间叶肉瘤端粒长度变化与相关调节蛋白表达的关系

目的:观察间叶肉瘤端粒长度与P53、C-myc、TRFl、POTl、hTERT等相关调节蛋白的表达,探讨间叶肉瘤端粒长度变化规律及意义.方法:采用端粒荧光原位杂交和免疫组织化学方法检测了20例骨肉瘤、25例软骨肉瘤、19例横纹肌肉瘤、26例脂肪肉瘤中端粒长度、1'RFl、POTl、hTERT,及P53、c-mye蛋白表达,并统计分析其与肿瘤类型及内在相关性.结果:骨肉瘤端粒长度短于软骨肉瘤、脂肪肉瘤(P相似文献   

类泛素蛋白FAT10共价结合底物蛋白质的活性分析

 目的 探讨类泛素蛋白FAT10的C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域结合修饰底物蛋白质的活性。方法 分别将野生型全长FAT10,C末端双甘氨酸的缺失突变体FAT10ΔGG,分别包含N端、C端泛素结构域的截断突变体FAT10 N和FAT10 C构建到真核表达载体中,转染HEK293T细胞,并使用26S蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。利用Western blot方法检测野生型FAT10及其突变体结合底物蛋白质的活性。结果 与野生型FAT10的蛋白质底物结合能力相比,FAT10ΔGG、FAT10 N、FAT10 C与底物蛋白质结合能力均显著下降。蛋白酶体抑制剂MG132能够促进FAT10及其突变体的底物结合活性。结论 FAT10的C末端双甘氨酸基团及双泛素结构域都是FAT10与底物共价结合所需的活性基团,被FAT10标记后的底物蛋白质通过26S蛋白酶体途径降解。     

p53301-393突变体的细胞定位及对有丝分裂的影响

目的:研究p53N端缺失突变体(301-393氨基酸)的绿色荧光融合蛋白p53301-393-GFP在p53阳性和阴性细胞中的定位以及对有丝分裂的影响。方法:免疫印迹检测突变体融合蛋白的表达。将野生型p53-GFP和p53301-393-GFP质粒,分别转染p53阳性细胞株HeLa和p53阴性细胞株H1299,观察各融合蛋白的细胞定位。观察转染突变体后H1299细胞生长情况,计数有丝分裂期的细胞数。HeLa细胞转染突变体后,流式细胞仪检测细胞周期,免疫印迹检测p53蛋白水平的改变。结果:p53301-393-GFP融合蛋白能正确表达。突变体在p53阳性和阴性细胞中都弥散定位于细胞核,但只在p53阳性细胞中才定位于核仁。p53301-393-GFP融合蛋白对H1299细胞的有丝分裂有明显的抑制作用,使进入有丝分裂期的细胞数量明显较对照组减少,且能够诱导凋亡。转染突变体的HeLa细胞产生G2/M期阻滞(P<0.05),但是内源性p53蛋白水平无明显改变。结论:p53301-393-GFP突变体在p53阳性和阴性细胞中有不同的细胞定位,并能抑制细胞的有丝分裂,使细胞发生G2/M期阻滞。     

PICK1蛋白83位点氨基酸对PDZ结构域的影响

目的:研究PICK1 (protein interacting with C kinase 1)蛋白PDZ结构域内83位点赖氨酸( K83)对PICK1和AMPA受体GluR2亚单位相互作用的影响.方法:利用计算机对PICK1 PDZ结构域和GluR2 C末端4个氨基酸残基进行对接模拟,然后将K83进行虚拟点突变,计算并观察突变后结构和键能的改变.利用实验室已有的野生型全长PICK1 cDNA质粒为模板,构建点突变质粒,与野生型GluR2共转到HEK293T细胞,观察两者在细胞内定位和分布的改变.结果:当野生型PICK1与GluR2共转染时,HEK293T细胞有大量PICK1和GluR2共定位的集簇(cluster).当我们把构建的PICK1突变体与GluR2共转染时,不同的突变体表现出不一样的改变.结论:改变K83位点的氨基酸结构,很可能会改变PICK1 PDZ结构域与GluR2 C末端结合所形成的疏水、氢键、静电相互作用,使得PDZ结构域与GluR2 C末端的结合能力发生不同程度的改变.     

TRF-1和Tankyrase 1 mRNA在口腔鳞癌细胞中的表达

目的研究端粒相关调控蛋白端锚聚合酶-1（Tankyrase 1）和端粒重复序列结合因子-1（TRF-1）在口腔颌面部鳞癌细胞中的表达，初步探讨Tankyrase 1对端粒酶活性调控的机制。方法应用组织总RNA抽提技术和实时定量PCR技术进行口腔颌面部肿瘤组织mRNA表达水平的检测，比较了人口腔颌面部鳞癌细胞、良性肿瘤细胞及正常口腔黏膜细胞中Tankyrase 1和TRF-1基因表达的差异及相关性。结果TRF-1 mRNA在口腔颌面部鳞癌细胞、良性肿瘤细胞中的平均表达量显著降低，与正常口腔黏膜细胞对照组相比，差异均具有极显著性意义（均P〈0．01），但鳞癌细胞组与良性肿瘤细胞组相比，差异无显著性意义（P〉0．05）；Tankyrase 1 mRNA的表达在鳞癌细胞组分别高于良性肿瘤细胞组和正常对照组，差异均有显著性意义（均P〈0．05），而良性肿瘤细胞组与正常对照组相比，差异无显著性意义（P〉0．05）。结论端粒酶活性正向调控因子Tankyrase 1以及逆向调控因子TRF-1在口腔颌面部鳞癌细胞中的表达异常，可能是引起口腔颌面部鳞癌细胞端粒酶活性增高的因素之一。     

小鼠金属硫蛋白-I在大肠杆菌中的 表达与分离纯化

在大肠杆菌中表达小鼠金属硫蛋白-I,并研究其分子结构和生物学功能。方法将小鼠金属硫蛋白-I基因克隆入融合表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,得到含重组表达质粒pGMA的工程菌。结果经IPTG诱导,表达出分子量约为33KD的融合蛋白。然后经Glutathione-Sepharose4B亲和纯化后,用凝血酶切除GST部分。经SephacrylS-100过滤纯化,得到结合有Cd2+的小鼠金属硫蛋白-I。产率约为3mg/L培养液。结论成功制备了表达MT的工程菌。     

一种新型原核表达载体的构建及应用

目的 利用基因重组技术构建一种新型原核表达载体，使之表达带有His和GST标签的融合蛋白。方法 以质粒pGEX为模板，将PCR扩增出的GST基因插入到载体pQE-30中构建pQE-30-GST，经IPTG诱导GST蛋白表达并用Westernblot鉴定。分别将huNSEl88-354、huPrP23-91和huDoppe124-152基因插入pQE-30-GST，转化E-coliM15并诱导表达融合蛋白。采用NiSepharose4B和(或)Glutathione Sepharose 4B纯化融合蛋白，并用羟胺裂解。结果 重组表达载体pQE-30-GST可有效地表达各种His-GST融合蛋白，并可用两种方法纯化不同大小的融合蛋白；利用羟胺可将目的蛋白肽段与His-GST蛋白有效裂解。结论 新型原核表达载体pQE-30-GST可进行多种蛋白质的表达，表达的蛋白质可经两种方法纯化以提高蛋白质的纯度，融合蛋白可经羟胺裂解获得目的蛋白质单体。     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的 :表达GST p11和 6xHis p11融合蛋白并制备GST p11特异性抗体。方法 :将人p11基因克隆入两种原核表达载体pGEX 4T 2和pQE30 ,分别在大肠杆菌BL2 1和M15中表达 ,用GlutathioneSepharose 4B和Ni NTAagar ose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST p11蛋白制备多克隆抗体。结果 :得到高表达量的融合蛋白 ,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST p11和 6xHis p11蛋白。以GST p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体 ,Westernblotting证实该抗体能够识别 6xHis p11蛋白 ,具有较高特异性。结论 :利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性 ,为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障     

癌蛋白PRC17与人肌球蛋白调节轻链相互作用的初步鉴定

目的：分析前列腺癌基因17（PRC17）与人肌球蛋白调节轻链（MLC2）之间的相互作用,并鉴定PRC17蛋白序列上与MLC2相互作用的功能区域。方法：经大肠杆菌表达并用GlutathioneSepharose4B纯化GST及融合蛋白GST-MLC2,用SMMC-7721细胞表达带HA标签的PRC17及其截短突变体HA-PRC17（353）、HA-PRC17（251）、HA-PRC17（164）和HA-PRC17（A164）,GST沉淀实验分析GsT-MLC2与PRCl7及其截短体的相互作用。结果：经诱导表达并纯化的GST和GST-MLC2分子质量符合预期,分别约为28．4kD和46．6kD,纯度均95％以上;GST沉淀实验结果显示,PRC17结合MLC2,不结合阴性对照GST;PRC17（353）和PRC17（251）也能有效结合MLC2,但PRC17（164）和PRC17（A164）都不能与MLC2结合。结论：PRC17能特异性结合MLC2,其蛋白序列上与MLC2结合的部位位于其氨基端251位氨基酸之内,可能在164位氨基酸附近。     

p11融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的：表达GST－p11和6xHis-p11融合蛋白并制备GST－p11特异性抗体。方法：将人p11基因克隆人两种原核表达载体pGEX-4T-2和pQE30,分别在大肠杆菌BL21和M15中表达，用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白。利用纯化的GST－p11蛋白制备多克隆抗体。结果：得到高表达量的融合蛋白，经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST－p11和6xHis-p11蛋白。以GST－p11蛋白免疫新西兰兔得到p11多克隆抗体，Westernblotting证实该杭体能够识别6xHis-p11蛋白，具有较高特异性。结论：利用原核表达人p11融合蛋白制备的p11多克隆抗体具有较好的特异性，为研究p11蛋白在蛋白转运和定位过程中的作用提供重要的技术和材料保障。     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

EB病毒GST-Rta融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化EB病毒的重组融合蛋白谷胱氨肽S转移酶（GST）-Rta185和GST-Rta150,并制备特异性多克隆抗体。方法 质粒表达载体pGEX-R185I、pGEX-R150I和pGEX-5X-3分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中,异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化目的蛋白。将纯化后的GST-R185、GST-R150和GST蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清。结果 在细菌裂解液中检测到高表达量的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-Rta融合蛋白。应用Western blot和ELISA方法检测证实,用纯化的GST-Rta蛋白免疫家兔得到了特异性的多克隆抗体。结论 通过上述方法制备出来的融合蛋白纯度较高,免疫家兔获得的多克隆抗体具有良好的特异性,为研究EB病毒Rta蛋白及与EB病毒相关疾病的诊断和治疗提供了重要的条件。     

多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定

目的：制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础。方法：构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST-SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性。结果：成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性。结论：成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具。     

利用谷胱甘肽S转移酶表达标签捕获系统性红斑狼疮相关基因IFIT1的相互作用蛋白质

目的　试图运用蛋白组学的策略研究系统性红斑狼疮 (SLE)相关的干扰素诱导蛋白IFIT1的蛋白质相互作用 ,以揭示其可能的功能。方法　应用荧光实时定量PCR进一步验证SLE患者外周血白细胞转录水平IFIT1基因的表达 ;应用分子克隆技术在大肠杆菌克隆并表达谷胱甘肽S转移酶 (GST) IFIT1融合蛋白 ;利用GST表达标签 ,以GST IFIT1为饵蛋白捕获SLE外周血白细胞蛋白裂解物中与IFIT1存在相互作用的蛋白质 ,MALDI TOF MS肽指纹图谱进行蛋白质鉴定。结果　荧光实时定量PCR证实IFIT1基因确在SLE(4 0例 )较正常对照 (2 9例 )表达上调 (P <0 0 0 1)。克隆表达了GST IFIT1融合蛋白 ,并捕获到一个与IFIT1存在相互作用的蛋白质 ,经肽指纹图谱初步鉴定为Rho/Rac鸟嘌呤核苷交换因子。结论　IFIT1是SLE新的相关基因。运用蛋白组学的策略研究IFIT1蛋白质水平的相互作用显示 ,IFIT1与Rho/Rac鸟嘌呤核苷交换因子存在相互作用 ,IFIT1可能通过该途径影响Rho蛋白的活化 ,参与SLE的发病。     

GST与FGF23C末端71个氨基酸融合蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的:构建和表达谷胱甘肽-S-转移酶（GST）与成纤维细胞生长因子23(FGF-23)的活性片段-C末端71个氨基酸（FGF23CTR）融合蛋白的基因工程菌,并检测融合蛋白的免疫原性,为制备FGF23特异性单克隆抗体以及研发慢性肾病诊断试剂提供实验数据。方法：以质粒pET22b-fgf23为模板利用PCR方法扩增FGF23CTR的基因片段,将该基因与表达载体pGEX-4T-1连接后转化至BL21宿主细胞中,通过IPTG诱导获得可溶性表达,将GST-FGF23CTR融合蛋白用Glutathione Sepharose4B亲和层析法纯化,Western blotting法鉴定蛋白。该融合蛋白免疫Balb/C小鼠制备抗血清,采用ELISA法检测抗血清的效价。结果：构建GST-FGF23CTR融合蛋白的表达载体,纯化后得到纯度90%以上的融合蛋白,并与商品化的FGF23多克隆抗体呈阳性反应,ELISA法证实融合蛋白具有良好的免疫原性。结论：成功构建GST-FGF23CTR融合蛋白基因工程菌,并纯化得到具有良好免疫原性的融合蛋白,以此方法制备的抗原可用于FGF23特异性单克隆抗体的制备和FGF23生物学功能研究。