多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定

目的：制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础。方法：构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST-SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性。结果：成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性。结论：成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具。     

大鼠坐骨神经缺损后背根神经节组织lncRNA表达变化

目的:研究大鼠坐骨神经缺损后背根神经节中长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的表达变化。方法:建立SD大鼠坐骨神经损伤0天、1天、4天和7天模型,取背根神经节组织进行lncRNA检测,进行差异基因的筛选,并应用实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(qRT-PCR)对芯片结果进行验证;利用lncRNA与mRNA特异性表达的标准化信号强度,构建基因共表达网络。结果:共筛选出24个显著下调的lncRNAs,qRT-PCR检测的lncRNA AF130881和AB020616的表达变化与芯片一致。得到与lncRNA AF130881和AB020616正向或负向共表达的蛋白编码基因25个。结论:大鼠坐骨神经缺损后背根神经节组织中lncRNA的表达谱发生改变。     

坐骨神经损伤早期背根神经节组织microRNA的表达变化

目的研究大鼠坐骨神经损伤以后短时间背根神经节组织中microRNA(miRNA)的表达变化。方法采用miRNA芯片检测神经损伤0 h(对照组)、3 h和9 h(实验组)背根神经节组织miRNA的表达情况,应用real time Taqman PCR对芯片结果进行验证。结果损伤3 h实验组与对照组比较发生上调和下调1.3倍以上的miRNA分别有4个和2个,损伤9h实验组与对照组比较发生上调和下调1.3倍以上的miRNA分别有7个和5个,real time Taqman PCR检测miR-188和miR-500的表达变化与芯片一致。结论大鼠坐骨神经损伤3h和9h后背根神经节组织中miRNA的表达谱发生改变。     

坐骨神经缺损1周背根神经节组织中microRNA的表达变化

目的：研究大鼠坐骨神经缺损后背根神经节中microRNA（miRNA）的表达变化。方法：采用miRNA芯片检测神经缺损0 d（对照组）和7 d（实验组）背根神经节组织中miRNA的表达情况,应用Real time Taqman PCR对芯片结果进行验证。结果：实验组与对照组比较发生上调1.4倍和下调〉1%以上的miRNA分别有13个和5个,Real time TaqmanPCR检测的4个miRNA的表达变化与芯片一致（上调：miR-21,miR-221;下调：miR-500,miR-551b）。结论：大鼠坐骨神经缺损1周后背根神经节组织中miRNA的表达谱发生改变。     

多疣壁虎Fstl1基因表达及其在断尾损伤中的变化

目的：研究多疣壁虎卵泡抑制素相似蛋白1（Fstl1）基因的表达及其在壁虎断尾损伤再生中的变化。方法：通过对多疣壁虎断尾损伤cDNA文库克隆测序获得Fstl1基因序列,并采用ClustalX软件比较GenBank同源蛋白进行系统进化分析。用Northern blot与原位杂交分析多疣壁虎Fstl1转录本大小及其在脊髓中的表达定位。通过RT-PCR方法研究Fstl1基因在壁虎主要组织中的表达分布与壁虎断尾损伤模型中变化。结果：基因系统进化分析表明,多疣壁虎Fstl1与人类Fstl1同源性较高,为96.5%;与爪蟾同源性较低,为62.9%。Northen blot分析表明,成年多疣壁虎Fstl1脊髓转录本大小约为3.7kb。原位杂交结果显示,多疣壁虎脊髓中Fstl1的阳性信号主要存在于灰质神经元细胞及室管膜细胞;而在断尾再生2～3周尾芽中,Fstl1阳性信号广泛存在于再生尾芽的新生区未分化细胞及间充质细胞,3周尾芽中,阳性信号还存在于软骨生成区。RT-PCR结果显示,多疣壁虎Fstl1基因在壁虎脑、脊髓、心、肝、肺、肾、卵巢、尾巴、肌肉中均有表达,其在脊髓中呈高表达。在断尾损伤模型中,多疣壁虎Fstl1表达呈动态变化,其在近端脊髓组织中,损伤3天时Fstl1转录表达增高,并随后开始下降恢复;在断尾再生尾芽中,3周时Fstl1转录表达低于2周表达量。结论：Fstl1基因主要分布于脊髓灰质神经元细胞中,Fstl1在壁虎断尾损伤后近端脊髓的表达呈动态变化,在再生尾芽表达3周下调。     

microRNA与神经发育及再生

microRNA (miRNA)是一类内源性的非编码短小单链RNA,长度约为20～23个核苷酸.miRNA的功能极其复杂,主要是通过与靶基因mRNA的3′-UTR(3′-untranslated region)完全或不完全配对,导致靶标mRNA降解或转录后翻译抑制,从而在基因的转录后调控中发挥重要的作用[1],实现对细胞增殖、凋亡、分化、新陈代谢等过程的调节[3].1种miRNA可调控数百个靶基因的表达,同时不同的miRNA可以协同调控同一个基因,这就使得miRNAs与其靶分子组成1个复杂的调控网络,在细胞及生物体的各种活动中发挥重要的作用[3].近来的研究表明miRNA与神经系统的发育和神经系统损伤修复等有着密切的关系,使miRNA成为神经系统研究又一新的焦点.     

兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清的制备及鉴定

目的:制备兔抗多疣壁虎Hoxc10抗血清并进行特性鉴定.方法:构建pGEX-4T1 -g-Hoxc10质粒,转化大肠杆菌BL21后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG)诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶( GyST) -g-Hoxc 10蛋白.用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备Hoxc10抗血清.用Western blot和免疫组化染色法检测Hoxc10抗血清的特性.结果:构建的多疣壁虎Hoxc10基因的原核表达质粒pGEX-4T1 -g-Hoxc10,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的Hoxc10融合蛋白,以其免疫大白兔获得较高效价的Hoxc10抗血清.Western blot及免疫组化染色法检测显示,所得抗血清具有较高的效价及特异性.结论:利用原核表达的多疣壁虎GST-g-Hoxc10融合蛋白制备的Hoxc10抗血清效价高,特异性良好,为进一步深入研究Hoxc10的功能提供了重要的制剂.