多疣壁虎SPARCL1多克隆抗血清的制备及鉴定

目的：制备针对多疣壁虎SPARCL1的多克隆抗体,为深入研究SPARCL1基因功能奠定基础。方法：构建pGEX-4T1-SPARCL1质粒,在大肠杆菌BL21表达GST-SPARCL1蛋白,经亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔,获得SPARCL1抗血清,经酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测SPARCL1抗血清的效价,Western blot和免疫组化法检测多克隆抗体特异性。结果：成功构建多疣壁虎SPARCL1基因的原核表达质粒pGEX-4T1-SPARCL1,诱导得到较高纯度的GST-SPARCL1融合蛋白,免疫兔获得SPARCL1抗血清,经Western-blot及免疫组织化学实验显示所得抗体具有较高的效价及特异性。结论：成功获得较高效价特异性强的SPARCL1抗血清,为进一步深入研究多疣壁虎SPARCL1功能提供抗体工具。     

神经再生素对皮层细胞基因表达影响的基因芯片研究

目的：采用基因芯片技术，观察神经再生素对体外培养的胚鼠大脑皮质细胞基因表达的影响。方法：取ICR胚鼠（15d)大脑皮层细胞，无血清培养。实验组加入神经再生素（2μg/ml）,对照组加入等量基础培养液。培养6h后，抽提实验组和对照组皮层细胞总RNA，经反转录分别用Cy5、Cy3荧光标记成cDNA探针。将荧光标记的cDNA与MGEC－40s基因表达谱芯片杂交，芯片扫描、数据处理。结果：实验组与对照组大脑皮质细胞出现64条差异性表达的基因。呈现上调的基因有：钙调素结合蛋白、锌指蛋白激酶、核糖体蛋白等基因；下调基因有：抑制细胞分裂因子等基因。结论：神经再生素可作用于体外培养的胚鼠大脑皮层细胞，从基因调控水平促进脑细胞生长。     

pAdCMV-tk/pJM17同源重组及扩增方法的研究

目的 :探讨磷酸钙沉淀法同源重组穿梭质粒 p Ad CMV- tk与腺病毒基因组改装质粒 p JM17的可行性。方法 :用磷酸钙沉淀法将质粒 p Ad CMV- tk与质粒 p JM17共转染至 2 93细胞 ,获得复制缺陷的重组腺病毒 Ad-CMV- tk,将其在 2 93细胞中扩增 ,氯化铯密度梯度离心法纯化扩增病毒 ,空斑实验测定病毒滴度。结果 :质粒 Ad-CMV- tk与质粒 p JM17在 2 93细胞中同源重组后 7～ 10天出现完全的细胞病变态反应。纯化后病毒滴度为 3× 10 1 0pfu/ ml。结论 :磷酸钙沉淀法能成功获得同源重组病毒 ,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒可得高滴度腺病毒     

卵巢癌实体瘤ERCC2表达与肿瘤发生及耐药的关系

目的:探求ERCC2表达与人卵巢癌实体瘤发生、耐药的关系。方法:分别取23例卵巢癌实体瘤、癌旁正常组织、培养及加药培养卵巢癌实体瘤组织各100 mg,提取组织中总RNA,采用RT-PCR的方法分析细胞中ERCC2表达水平。结果:5例标本中,ERCC2在卵巢癌实体瘤表达显著低于癌旁正常组织。20例实体瘤标本经更生霉素、环磷酰胺、顺铂、5-氟尿嘧啶、阿霉素处理后ERCC2分别增加18.2 %、72.0 %、104.9 %、14.1 %、23.2 %。结论:ERCC2在部分卵巢癌实体瘤患者中低表达,可能是这些卵巢癌实体瘤患者细胞恶变形成的基础。卵巢癌实体瘤患者对更生霉素、环磷酰胺、顺铂、5-氟尿嘧啶、阿霉素耐药程度不同。     

肾小球上皮足突细胞培养

目的 :分离培养肾小球上皮足突细胞。方法 :机械分离低龄SD大鼠肾小球、胰酶 ,胶原酶消化后接种于选择性培养基K1体系 ,使肾小球大于 6 0个 /cm2 ,培养 8～ 10天后收获细胞 ,用形态学特征 ,嘌呤酶素选择性杀伤作用 ,抗受体相关蛋白 (RAP)免疫荧光技术鉴定细胞类型。结果 :收获的培养细胞为肾小球上皮足突细胞。结论 :该法能较为快捷、准确地获得所需的培养细胞类型。     

Jagged1基因敲除小鼠血管内皮发育异常

目的:探讨Jagged1基因敲除小鼠模型中,胚胎血管发育异常和血管重塑严重缺陷。方法:通过基因型鉴定确认纯合子Jagged1基因敲除小鼠(Jag-/-),分析9.5天小鼠胚胎血管发育状态和血管内皮超微结构;分离胚胎内皮细胞培养于I型鼠尾胶中,观察环样结构生成。结果:与正常野生型小鼠相比,纯合子Jagged1基因敲除小鼠血管内皮延伸段薄弱,内皮连接以点状连接为主,存在明显的结构缺陷;分离获得的胚胎内皮细胞鼠尾胶培养时,环样结构生成能力下降。结论:Jagged1基因敲除可导致小鼠血管内皮发育异常,内皮结构的脆弱,成环能力下降,是纯合子基因敲除小鼠胚胎广泛出血现象的发育结构基础。     

神经再生素激活PC12细胞ERK1/2的实验研究

本实验初步探讨了神经再生素 ( NRF)作用于 PC12细胞的信号传导途径。采用 MTT法检测 NRF对无血清培养的PC12细胞存活率的影响 ;用磷酸化的 Elk单克隆抗体 ,通过 Western blot法观察 NRF的不同浓度 ( 10、10 0、10 0 0 ng/ m l)及不同作用时间 ( 0 min、15 min、3 0 min、1h、2 h)对无血清培养的 PC12细胞 ERK1/ 2活性的影响 ;还运用 MEK1/ 2阻断剂 U0 12 6,观察NRF激活 ERK1/ 2是否需要其上游信号蛋白 MEK1/ 2的激活。结果表明 ,NRF作用于无血清培养的 PC12细胞 ,可以激活ERK1/ 2 ,存在明显的剂量效应关系和时间依赖作用 ,在 10 0 0 ng/ ml浓度下最大 ,作用 2 h时达峰值 ;U0 12 6作用后 ,可抑制 NRF作用于 PC12细胞引起的 ERK1/ 2的激活。由此可见 ,NRF对无血清培养的 PC12细胞具有保护作用 ,可能通过激活 ERK1/ 2磷酸化级联途径来介导这些作用。     

神经再生素对大鼠大脑皮层细胞的作用

目的：观察神经再生素(NRF)作用于离体培养的SD大鼠大脑皮层细胞过程中细胞活性、基因的表达变化，探讨MRF促神经生长机制。方法：SD大鼠大脑皮层细胞分离、培养于含NRF L15培养基，采用RT-PCR方法检测培养细胞生长相关蛋白43(GAP-43)、神经丝蛋白(NF-L)和锌指样蛋白(DDP2)基因经NRF作用后基因表达变化，MTT法检测细胞活力。结果：2μg/ml NRF作用于培养大脑皮层细胞为较佳使用浓度；NRF作用6～12h，GAP—43、NF-L和DDP2基因表达分别上调至峰值200％，150％，135％；NRF作用24h后，基因表达回复至正常值，而细胞活力仍上调23．2％。结论：NRF可通过上调神经生长相关基因表达，提高细胞活力达到促神经生长。     

抗RAP抗体对肾小球上皮足突细胞RAP基因表达调控

目的：研究抗ＲＡＰ抗体对肾小球上皮足突细胞ＲＡＰ基因表达调控。方法：受体相关蛋白（ＲＡＰ）多抗，作用于体外分离培养的ＳＤ大鼠肾小球上皮足突细胞１２小时，以模拟Ｈｅｙｍａｎｎ肾炎（ＨＮ）模型体内循环抗体作用于肾小球发病过程，采用ＲＴ－ＰＣＲ半定量分析的方法研究肾小球足突细胞受体相关蛋白基因表达。结果：ＲＡＰ多抗作用于培养肾小球上皮足突细胞使得细胞ＲＡＰ基因表达增高。结论：ＲＡＰ循环抗体调控肾小球上皮