鼠源性抗HBV-TP可变区抗体基因的克隆及原核表达

目的:扩增鼠源性抗HBV末端蛋白(HBV-PT)mAb轻、重链可变区(VL,VH)基因,构建sFv原核表达载体并于大肠杆菌中表达.方法:从鼠源抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞(E3)中提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,以鼠源简并性引物PCR扩增抗体的VL和VH基因,克隆到pGEM-T Easy载体,测序并对其结构进行分析.选择序列正确的克隆,分别构建VL及VH的PBV220原核表达载体,42℃诱导表达,Western blot鉴定表达产物.结果:经测序证实,所克隆的VL基因为363 bp,VH基因为375 bp,两者序列与鼠抗体的同源性均大于80%.构建了鼠抗HBV-PT抗体基因VL及VH的PBV220原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.表达产物经SDS-PAGE及Western印迹分析与羊抗鼠IgG产生特异反应.结论:抗HBV末端蛋白轻、重链可变区基因的克隆及表达为进一步探讨HBV感染患者的免疫治疗奠定了基础.     

抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)外膜蛋白gp120单链抗体基因的构建及测序鉴定

目的　构建抗HIV 1gp120单链抗体基因,为进一步用于HIV 1感染的诊断和治疗奠定基础。方法　利用 RT PCR法,从抗HIV 1gp120单克隆抗体杂交瘤细胞扩增得到抗体轻链和重链的可变区基因,经重叠延伸反应, 在体外随机合成单链抗体基因(ScFv),并克隆到pGEM Easy T载体中,经测序及Blast同源性分析。结果　该 ScFV基因全长为666bp,为VH Linker VL结构,VH基因为396bp,编码132个氨基酸;Linker为(Gly4Ser)3短 肽;VL基因为270bp,编码90个氨基酸。VH基因与小鼠IgG2a重链可变区的同源性达95%,VL基因与小鼠免 疫球蛋白κ轻链可变区的同源性达98%。结论　成功构建了抗HIV 1gp120单链抗体基因。     

人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定

目的：建立人破伤风免疫噬菌体抗体库，筛选抗破伤风类毒素的抗体基因，并在大肠杆菌中表达可溶性Fab段。方法：从破伤风类毒素免疫志愿者中分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，用一组人IgG Fab基因特异性引物，从合成的cDNA中经PCR扩增出抗体轻链(VL CL)和重链Fd(VH CHl)基因，分别经Xba Ⅰ／Sac Ⅰ和Spe Ⅰ／XhoⅠ酶切克隆入噬菌粒pComb3。用破伤风外毒素作为抗原进行筛选富集获得特异性抗破伤风类毒素的噬菌体抗体，切去噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ(gⅢ)，表达可溶性人抗破伤风类毒素的Fab段。结果：经核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人IgGFab基因；用ELISA鉴定表明，表达的人IgGFab抗体能特异性地与破伤风外毒素结合。结论：利用噬菌体抗体库技术筛选可得到与破伤风外毒素特异性结合的人抗破伤风类毒素基因工程抗体。     

抗人β-淀粉样肽特异性单链抗体的噬菌体抗体库的构建与初步鉴定

目的:运用噬菌体展示技术构建抗人β-淀粉样肽(Aβ)特异性单链抗体的抗体库并进行初步鉴定.方法:从Aβ免疫的BALB/c小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成其总cDNA.以PCR方法分别扩增出抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因片段,再经重组PCR将两基因片段由编码十五肽(Gly4Ser)3的接头连在一起,克隆到噬菌粒载体pCANTAB 5E中,转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07超感染后回收全部重组噬菌体,构建噬菌体抗体库,SDS-PAGE鉴定纯度.结果:经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350bp和325 bp,与预期VH,VL基因片段理论值相符.经重组PCR得到大小约750 bp的ScFv基因片段.ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为1.1×10<'8>的噬菌体抗体库,经SDS-PAGE鉴定,得到M,约为30000 ku,纯度较好的scFv抗体.结论:成功构建了库容量大的特异性噬菌体抗体库,为抗人Aβ特异性抗体的筛选、生物活性鉴定、临床实验诊断方法建立和治疗应用打下基础.     

抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子...     

抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达

目的 构建抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体原核表达载体，为进一步研究其效应奠定基础。方法 从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体pGEM-T-VH和pGEM-T-VL中扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，用重叠延伸PCR的方法，在VH和VL基因间引入连接短肽(Linker)，构建VH-Linker-VL的单链抗体(single chain Fv，scFv)基因。经NcoⅠ和NotⅠ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUCl9／119上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达。间接免疫荧光法(IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性。结果 凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约700bp条带，SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量为27kD左右，与scFv的理论值一致，IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性。结论 本研究成功地构建并表达了抗人TfR scFv，为抗人TfRscFv的应用奠定了基础。     

抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因的克隆及重组表达载体的构建

目的　构建抗腮腺炎病毒抗体Fab段基因重组表达载体。方法　从腮腺炎患者和腮腺炎抗体IgG阳性正常人群的淋巴细胞中提取总RNA ,逆转录成cDNA。用相应的引物进行PCR ,扩增出轻链和重链Fd段基因 ,经酶切后分别和噬粒载体pComb3连接 ,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1 blue菌株 ,将轻链和重链Fd基因先后克隆入pComb3中。结果　从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约 1 1 0 μg ,经逆转录、PCR ,分别扩增出约 70 0bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接 ,在 2 5kv,2 0 0Ω ,2 5 μF的条件下电转化 ,最终转化率为 :2 4 8× 1 0 7。随机挑取电转化后的 1 0个菌落 ,经PCR鉴定 ,共有 5个克隆同时含有轻链和重链Fd基因 ,抗体Fab的重组率为 5 0 %。结论　获得的抗体Fab重组表达载体是高效、实用的 ,为下一步构建抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库打下基础     

抗vWF-A3区特异性单抗SZ-123单链抗体的构建和表达

目的 以能与vWF-A3区特异结合的单克隆抗体SZ-123为模板,构建其单链抗体,为深入研究vWF-A3结构与功能的关系提供有力的工具.方法 通过逆转录及多聚酶链反应,扩增并克隆单抗SZ-123的可变区基因VH、VL,经测序后加入连接肽,构建成SZ-123单链抗体(SZ-123 ScFV),并在大肠杆菌中进行表达.采用酶联免疫吸附试验( ELISA)和Western blot方法验证SZ-123 ScFV的免疫原性.结果 VH、VL可变区基因符合小鼠抗体可变区特征,SZ-123 ScFV基因拼接正确.表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的20％.经过变性和复性后,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段.结论 成功表达了SZ-123单链抗体,该小分子抗体具有特异结合vWF-A3区的能力.     

抗人大肠癌抗体CAb-1 Fab基因的克隆、表达和鉴定

目的:从杂交瘤细胞中克隆mAb CAb-1所编码Fab抗体基因,并在大肠杆菌中进行表达和鉴定.方法:采用RT-PCR方法,扩增mAb CAb-1的Fd片段和全长κ链基因,分别克隆到T载体后进行序列测定和分析.依次亚克隆两个基因到噬粒pComb3中,去除该载体上的gIII基因,构建成分泌表达载体Fd-L/pComb3.转化XL1-Blue E.coli菌株,IPTG诱导表达.采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性.结果:克隆了大肠癌mAb CAb-1的Fab基因,并在E.coli中获得表达.产物CAb-1 Fab具有与大肠癌细胞株SW480特异结合的活性.结论:成功构建了在E.coli中表达抗人大肠癌mAb CAb-1的小分子单价Fab抗体的载体.     

抗血管内皮生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与？…

获得抗血管内皮生长因子１６５抗体的轻重链可变区基因。方法从分泌具有中和抗血管皮生长因子１６５活性的单抗杂交瘤细胞株Ｖｍｄ１１中提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆该单抗的轻，重链可变区基因并进行序列分析。     

抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析

目的:获取抗人CD14单克隆抗体(单抗)ZCH-7-2F9(简称2F9)轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,为2F9单链抗体(ScFv2F9)的构建奠定基础。方法:复苏2F9和NS-1细胞株,并亚克隆2F9细胞株,从其最佳克隆93A10提取总RNA,RQ1 RNase-Free DNase处理污染的DNA,与NS-1细胞进行同步对照,通过RT-PCR,扩增获得2F9单抗VL基因和VH基因,分别克隆入pGEM○R-T Easy载体,然后转化DH5α细菌,酶切鉴定并纯化阳性重组子,测序后进行在线核苷酸序列分析。结果:2F9单抗VL基因全长321 bp,编码107个氨基酸,归属于小鼠Ig的Vκ基因,氨基酸序列分析结果显示,VL含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第23位和第88位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸;其VH基因全长360 bp,编码120个氨基酸,归属于小鼠Ig的VH基因,氨基酸序列分析结果显示,VH含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区,在第22位和第96位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别是2F9单抗的VL和VH基因,为2F9基因工程抗体研究奠定了坚实的基础。     

Cloning and sequencing of the variable region genes of anti-human melanoma monoclonal antibody

EngineeringantibodyhasalreadyshoweditsgoodprospectsintumortherapyI'2-.AsmelanomaIsahighlymalignanttumor,itissignificantforthestudyofthetumortoacquirethevariableregiongenesandcorrespondingantibodyfragmentsofvariousanti--melanomamAbs.Itisknowntoallthattheessenceofpreparingengineeringantibodyistoobtainvariableregiongene:"':.Inthisstudy,RT--PCRmethodwasappliedtoamplifythevariableregiongenesoftheheavyandlightchainsofthemAbfromamurinehybrldonlacelllinewhichsecretsspecificantihumanmelanomamAbsa.T…     

抗人血管内皮生长因子单链抗体的构建和表达及其活性鉴定

目的 对能与人血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）特异结合,并对体内有抑瘤活性的单克隆抗体（Ｅ１１）进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体（ＳｃＦｖ）,为临床应用奠定基础。方法 通过逆转录及多聚酶链式反应,扩增并克隆Ｅ１１的可变区基因片段。用一编码亲水肽接头的ＤＮＡ片段将Ｅ１１轻、重链可变区基因连接,克建表达载体ＰＥＴ－１５ＹＶ,并导入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行表达。表达产物经变性及复性后,用免疫组     

Expression of Anti-CD4 Human/Murine Chimeric Antibody and Their Killer Tumor Activity

MonoclonalantibodiesagainstCD4molecule(anti-CD4McAb)ofhumanTlymphocyteshavebeensuccessfullyusedforthetreatmentofautoimmunediseasesandpreventionoforgantransplantationrejectioninhuman[1'Zj.However,murinemonoclonalantibodies(Ahs)haveimmunogenicityonhumanandproduceneutralizinghumananti-mouseantibodies(HAMA).ToreducetheimmunogenicityofmurineMcAbinhuman,chimericAhshavebeenproduced,inwhichtheVregionsofthemouseantibodywiththedesiredspecificityarecombinedwithhumanCregions["4j.Inthisstudy,anti-C…     

Construction and analysis of three-dimensional graphic model of single-chain Fv derived from an anti-human placental acidic isoferritin monoclonal antibody by computer

As a 24--iner consisting of different proportions of two main subunit types, named L and H,ferritin is a protein involved in iron storage. Inmammalian tissues, ferritin exists in differentmolecular forms (isoferritins )LI,2]. Previous studies showed that the acidic isoform of ferritin existing in the placenta, fetal tissues and malignant tissues was abnormally increased in the sera of patients with malignancies as well as in pregnantwomen at risk of having small--for--gestational ageinfants[3…     

鼠抗CD71单抗轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

目的：获得鼠抗人CD71分子单抗的轻链及重链可变区基因，方法：用一步法提取总RNA，逆转录形成cDNA，设计并合成一套扩增小鼠重，轻链可变区的通用引物，通过PCR扩增基因，分别克隆入pMD18-T载体中，作核苷酸序列分析。结果：用重链引物扩增获得长约350bp的片段，用轻链引物扩增获得长约330bp的片段，序列测定获得它们的DNA序列，结论：克隆的重链可变区基因长度为348bp，属于小鼠H链可变区IA亚组；克隆的轻链可变区基因长度为336bp ，属于小鼠K轻链可变区Ⅱ亚组。     

抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达

目的　构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法　用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PCR方法将 VH和 VL拼接在一起 ,构建抗人 AFP单链抗体的基因。将 Sc Fv基因克隆至 p GEM- T载体构建 ,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 Sc Fv基因连接到 p ET32 (a )质粒 ,转化 BL - 2 1(DE3)细菌。抗性生长的克隆用异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导 4 h。溶解细菌并纯化 Sc Fv,通过 SDS-PAGE电泳及竞争抑制 EL ISA实验检测其活性。结果　获得的 VH含 339bp,来自小鼠 Ig Gγ链 ,VL含 312 bp,来自小鼠κ链。 VH和 VL通过编码 (G4 S) 3连接肽的 4 5 bp序列连接在一起构成含 6 96 bp的 Sc Fv基因。 BL - 2 1(DE3)中表达的 Sc Fv抗体与融合蛋白 (Trx A)融合在一起并以包涵体的形式存在。 Trx A- Sc Fv相对分子质量约 4 0× 10 3,Sc Fv相对分子质量约 2 4× 10 3。竞争 EL ISA实验显示 :Trx A - Sc Fv可抑制 4 1%的 Mc Ab与抗原结合 ,而Sc Fv抗体则可抑制 5 3%的 Mc Ab与抗原结合。结论　我们成功构建了由 6 96个碱基组成的抗人 AFP单链抗体的基因 ,并在大肠杆菌获得了     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体死亡受体5嵌合抗体的构建及其真核表达

目的构建以人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体死亡受体5(DR5)为抗原的鼠/人重组嵌合抗体。方法采用基因工程技术,扩增和克隆抗DR5嵌合抗体的轻、重链表达载体,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-),筛选稳定分泌表达抗DR5嵌合抗体的细胞株。采用ELISA和Western bloting法鉴定抗体的人源性和抗体-抗原结合活性,四唑盐/吩嗪硫酸甲酯比色法检测抗体的生物学活性。结果获得了稳定表达和分泌抗人DR5的嵌合抗体(anti-DR5mV-hH)的重组细胞;与人DR5蛋白具有高的特异性结合活性;能使体外培养的人髓性白血病Jurkat细胞和人结肠癌HCT116细胞的存活率分别下降到73.15%和77.30%。结论抗DR5嵌合抗体anti-DR5mV-hH具有抗肿瘤活性,为发展人源化抗体药物的研究奠定了基础。     

抗乳腺癌人鼠嵌合抗体的构建

目的：构建抗人乳腺癌单克隆抗体人鼠嵌合抗体，降低鼠源性抗体应用于人体的免疫排斥反应。方法：采用RT－PCR技术，从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株CDI315B分离克隆抗体轻重链可变区基因，对其进行序列分析，将连接组建人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链，然后分别将它们克隆到真核细胞表达载体pcDNA3。结果：构建的人鼠嵌合抗体基因克隆在真核细胞表达载体上。结论：人鼠嵌合抗体的构建为它的表达和临床应用打下基础。