动物模型中人骨形态发生蛋白2重组腺病毒活性观测

目的:利用基因工程技术构建人骨形态发生蛋白2重组腺病毒,并进行体内表达,测定活性;为深入开展的基因治疗研究创造条件。方法:实验于2000-05/2002-06在西安交通大学第一附属医院骨科实验室完成。应用PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白2全长基因,体外同源重组构建重组腺病毒后,随机将30只SD大鼠分为治疗组和对照组,每组15只,将纯化后的重组腺病毒50μL注入SD大鼠股部肌肉陷窝病损处,通过组织学染色、X射线片对动物模型的组织变化进行观测。结果:6周后治疗组可见明显骨诱导形成,2周时治疗组碱性磷酸酶活性明显高于对照组,重组腺病毒治疗组有明显的诱导成骨活性。结论:应用于动物实验中目的基因表达,并具有生物学活性。本研究是在骨缺损基因治疗的一次尝试,且人骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功,也为国内骨科疾病基因治疗的进一步研究提供了基础。     

PEI增强G250 DNA疫苗和重组肽疫苗的prime-boost免疫策略研究

目的 :探讨PEI作为免疫佐剂对G250抗原肽基因PVAX1/C-G250肽-C免疫保护效果的增强作用及联合应用CAIX蛋白疫苗进行PRIME—BOOST免疫程序免疫增强效果。方法:用Eco R I、Xho I和Eco R I、Sal I分别双酶切PVAX1及既往构建的p ET28a(+)/C-G250肽-C质粒。利用DNA重组技术构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C,酶切分析鉴定。大量提取质粒并分光光度计测质粒含量。将32只雌性昆明小鼠随机分为(A)裸DNA组,(B)DNA-PEI复合物组,(C)DNA-PEI+蛋白疫苗组,(D)空白对照组。按0,10,20,30天程序经股四头肌注射免疫。C组在第20天及第30天进行蛋白冲击。初次免疫前和第40天鼠尾取血,ELISA法检测抗体滴度。流式细胞术测淋巴细胞亚群CD4+和CD8+。结果:酶切及基因测序鉴定证实G250抗原肽c DNA正确插入PVAX1/C-G250肽-C真核表达的重组质粒中。昆明小鼠经4次免疫后,3个实验组都产生了特异性的体液和细胞免疫反应,B组的抗体滴度1:1.28×104及CD4+、CD8+达26.12%和12.60%,明显高于A组的1:3.2×103和CD4+,CD8+占到19.32%和10.74%。而蛋白冲击组的1:5.12×104和CD4+,CD8+占到41.96%和15.14%,明显高于B组(P0.05)。结论:成功构建重组质粒PVAX1/C-G250肽-C。该DNA疫苗与PEI和G250蛋白疫苗联合使用后产生极强的免疫原性,诱导产生了高滴度、高特异性抗体及细胞免疫反应。证实G250DNA疫苗联合PEI使用并进行蛋白疫苗冲击的免疫策略可产生强大的免疫保护作用。为恶性肿瘤的术后辅助治疗提供新的思路和方法。     

用分子杂交方法研究鸭乙肝病毒感染和鸭肝病

嗜肝 DNA 病毒感染同肝炎、肝硬化和肝癌的相关关系是肝病学中的重大课题。除了 HBV 感染同人类肝病和肝癌的发生有关之外,一些动物嗜肝 DNA 病毒也有类似性。尽管 WHV、GSHV 和 DHBV 有类似于 HBV的形态、结构以及都能造成长期持续性感染,但 WHV 感染的土拔鼠和 GSHV 感染的金花鼠,两者的肝病病理学改变有显著差     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景:胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用.目的:构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒.方法:将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒.采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞.结果与结论:重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内.免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1.     

SAC重组腺相关病毒载体的构建及其对前列腺癌CAM移植瘤的抑制作用

目的 构建携带NT4-SAC-HA2-TAT融合基因的重组腺相关病毒载体,并感染前列腺癌鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)移植瘤,观察目的基因前列腺凋亡反应基因 4(par-4)选择性癌细胞凋亡结构域(SAC)的表达及其对CAM移植瘤的生长抑制作用。方法 利用磷酸钙共沉淀法将包装质粒pAAV/Ad、腺病毒辅助质粒pFG140及重组穿梭质粒pSSCMV/NT4-SAC-HA2-TAT共转染293细胞,制备重组腺相关病毒(rAAV), 斑点杂交法检测病毒滴度。取孵育9d龄健康鸡胚,CAM接种前列腺癌细胞系PC 3细胞,建立前列腺癌的CAM移植瘤模型,接种3d后挑选成瘤鸡胚随机分为3组：空白对照组(PBS),空病毒组(AAV)和重组病毒组(rAAV),观察瘤体生长情况,上述处理4d后测量比较不同组移植瘤体积,并切片染色病理检查。免疫荧光法检测移植瘤中SAC融合肽的表达。结果 酶切鉴定结果证实成功构建pSSCMV/NT4-SAC-HA2-TAT, 斑点杂交法检测重组病毒滴度约为3.34×1010～3.34×1011cfu/mL。免疫荧光法证实SAC融合肽表达。移植瘤能在CAM上生长,可见瘤周围丰富毛细血管汇集,rAAV组瘤体显著缩小,病理HE染色可见瘤细胞局限及侵袭抑制。结论 成功构建SAC重组腺相关病毒载体并感染前列腺癌CAM移植瘤,重组病毒表达分泌的SAC融合肽对前列腺癌CAM移植瘤具有诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭性增殖等作用。     

腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应.方法 应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率.结果 克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因.MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48 h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小.Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30 h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%.结论 通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的.     

重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9的构建及其对体外培养的大鼠耳蜗组织的转染

目的:包装携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9,并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法:使用pSSHG-CMV-NT4-ADNF-9,pGF140和pAAV/Ad 3种质粒共转染293包装细胞,制备ADNF-9重组腺相关病毒(recomb inate adeno-assoc iated virus,rAAV),应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度;体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞,于24 h后提取组织行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以检测rAAV-NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果:应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×1013cfu/m l,表明成功地构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,经RT-PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织得到了表达。结论:构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9,在体外可成功转染耳蜗组织,用于基因治疗的研究。     

392例HBsAg阳性急慢性肝炎和携带者血清δ系统的研究

本文应用国产丁型肝炎病毒(HDV)酶联免疫试剂对392份HBsAg阳性肝炎和携带者血清进行了抗-HD、抗-HDIgM和HDAg测定,HDV总感染率为10.7％(42/392)。其中以重型肝炎组HDV标志检出率最高,达27.8％,然后依次为慢性肝病(15.5％)和急性乙肝(5.3％),HBsAg阳性携带者无1例阳性。本研究资料提示HDV感染对HBV感染在加重肝损害、促进肝脏炎症进展及慢性化方面均起十分重要作用。HDV标志与HDV RNA的测定亦有较高的符合率(96.9％)。     

par-4 SAC基因的克隆及序列测定

目的:利用基因工程技术对 par-4 SAC 进行基因克隆并测定其序列,为进一步诱导肿瘤细胞靶向性凋亡的基因治疗奠定基础.方法:采用非对称互补引物/模板法,制备两端含有酶切位点的 par-4 SAC 的 cDNA,PCR产物克隆入 pGEM-T Easy 载体并转化感受态大肠杆菌 E.coli DH5α菌株,随机挑取数个菌落,筛选鉴定并测序.结果:经酶切鉴定、测序分析,表明所插入的基因片断为 par-4 SAC 基因,与设计完全相同.结论:应用非对称互补引物/模板法克隆 par-4 SAC 基因是成功及可行的.     

par-4 SAC基因的克隆及序列测定

目的：利用基因工程技术对par-4 SAC进行基因克隆并测定其序列，为进一步诱导肿瘤细胞靶向性凋亡的基因治疗奠定基础。方法：采用非对称互补引物／模板法，制备两端含有酶切位点的par-4 SAC的cDNA，PCR产物克隆人pGEM—T Easy载体并转化感受态大肠杆菌E．coli DH5α菌株，随机挑取数个菌落，筛选鉴定并测序。结果：经酶切鉴定、测序分析，表明所插入的基因片断为par-4 SAC基因，与设计完全相同。结论：应用非对称互补引物／模板法克隆par-4 SAC基因是成功及可行的。