菌落PCR快速分析抗体库重组率时的假阳性现象

目的　评价菌落PCR法鉴定噬菌体抗体库阳性重组率的可靠性。方法　鼠抗体基因Lc片段、Fd片段经酶切、纯化后 ,依次克隆入pComb3载体上相应的酶切位点 ,电转化XL1 blue菌后建立鼠源性Fab噬菌体抗体库。比较菌落PCR法、质粒PCR法及质粒酶切法鉴定转化菌阳性重组率的一致性。同时用空菌、空载体、空载体菌等作模板为对照PCR ,以排除相关组分的干扰。结果　建立的Lc库的库容为 1.175×10 6CFU ,Fab库的库容为 1.0 2×10 6CFU。 3种方法鉴定的阳性重组率不同 (Lc的重组率依次为 10 0 %、78%、78% ,Fd的重组率依次为 90 %、6 6 %、6 6 % ,Lc与Fd同时插入的重组率依次为 90 %、5 0 %、5 0 % )。菌落PCR法鉴定的重组率偏高 ,存在假阳性现象。对照PCR提示 ,XL1 blue菌本身可能是导致假阳性扩增的原因。结论　用菌落PCR法不能准确鉴定噬菌体抗体库的重组率 ,用质粒PCR法或质粒酶切法鉴定更为可靠     

构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达

目的:构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体,并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达。方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原HAb18G胞外段基因,SacI/NotI双酶切后插入真核表达载体pCEL2f中,构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体基因的重组表达载体pCEL2f/HAb18GEF,并经酶切和测序验证。将此重组表达载体与POG44载体(按1∶9的比例混合后),在阳离子脂质体介导下共转染HEK293-16工程细胞,用潮霉素B筛选定点整合表达EpoR/LR-F3/HAb18GEFcDNA的细胞克隆。用间接免疫荧光染色法、流式细胞术及Zeocin致死试验,检测并验证稳定表达株中EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的表达。结果:成功地构建pCEL2f/HAb18GEF真核重组表达载体,共转染后EpoR、HAb18GEF均高效表达于转染的HEK293-16细胞的胞膜上。经潮霉素B筛选得到12株可融合高表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF的稳定株,其表达EpoR的阳性率为99.93%,平均荧光强度(MFI)为1036.39,表达HAb18GEF的阳性率为99.51%,MFI为652.72,且可被Zeocin致死。结论:成功地建立了表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的HEK293-16工程细胞株,为进一步利用哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱(MAPPIT)系统筛选HAb18G的作用受体奠定了基础。     

次声作用对小鼠骨髓多染性红细胞微核的影响

目的　研究次声对小鼠骨髓细胞染色体的损伤效应 .方法　 BAL B/ c小鼠经 16 Hz,12 0 d B,2 h· d- 1 的次声分别作用 1,3,7,10 d后取股骨 .通过 PCE- MNT法和骨髓细胞染色体制备 ,检测并观察多染性红细胞微核率和分裂相染色体的变化 .结果　与对照组 (雄鼠 :0 .2 6‰ ,0 .35‰ ,0 .41‰ ,0 .40‰ ;雌鼠 :0 .2 6‰ ,0 .32‰ ,0 .38‰ ,0 .33‰ )相比 ,次声组 (雄鼠 :0 .45‰ ,0 .6 0‰ ,0 .81‰ ,0 .85‰ ;雌鼠 :0 .42‰ ,0 .6 0‰ ,0 .92‰ ,0 .72‰ )的平均微核率增加显著(P<0 .0 5 ) .次声组平均微核率的增幅随作用天数的延长而显著增加 (P<0 .0 5 ) ;雌雄小鼠间的平均微核率无显著差异(P>0 .0 5 ) .骨髓细胞分裂相检测明显可见有染色体结构畸变现象 .结论　次声作用对小鼠骨髓多染性红细胞遗传损伤显著 .在本实验条件下 ,次声作用存在时间累积效应 ,雌雄小鼠对其反应敏感性相同 .     

抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fd及轻链基因的克隆与鉴定

目的: 克隆抗人肝癌单抗HAb18 Fd及轻链基因，并对其可靠性和准确性进行验证。方法: 从分泌单抗HAb18的杂交瘤细胞株中提取总RNA，利用RTPCR扩增抗体Fd及轻链基因，连入pMD18T载体后，挑选阳性克隆进行序列测定并利用相应的软件对序列进行分析。然后将轻链及Fd基因依次克隆到噬菌体展示载体pComb3中，转化大肠杆菌XL1blue并利用辅助噬菌体M13K07进行挽救，收获噬菌体后利用间接ELISA方法检测其抗原特异性。结果: 扩增的HAb18全长轻链和Fd 基因大小分别为665 bp和668 bp，序列分析显示：VH及VL均含有2个特征性的半胱氨酸，CH1属于IgG1亚类，CL属于κ亚型。ELISA证实，Fab基因表达产物具有与相应抗原特异结合的活性。结论：成功克隆了肝癌单抗HAb18的Fd及轻链基因，为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。     

不同免疫方案制备抗HAb18G/CD147胞外区多克隆抗血清的比较

目的:制备针对肝癌相关抗原HAb18G/CD147胞外区不同表位的抗血清,比较不同免疫方案的免疫效果.方法:以原核表 达的GST HAb18GEF融合蛋白、重组真核表达质粒pcDNA3/HAb18G及HCC细胞为免疫原,分别采用蛋白常规免疫、DNA肌 肉免疫及pcDNA3/HAb18G HCCbooster(DNA cellbooster)免疫接种BALB/c小鼠.采用间接ELISA和细胞ELISA,同时测定免 疫血清中抗变性和天然HAb18GEFIgG抗体的滴度和Ig亚类.用Westernblot检测各免疫方案制备的抗血清,与变性 HAb18GEF抗原结合的特异性.用免疫荧光法验证DNA cellbooster免疫接种法制备的抗血清,与细胞膜上天然HAb18G抗原的 结合特异性.结果:以GST HAb18GEF常规免疫后,可诱导高滴度的IgG1抗体产生,但针对的多为HAb18GEF的变性或线性表 位;以pcDNA3/HAb18G肌肉免疫后,可诱导针对其天然表位的IgG2a抗体产生,但滴度较低;以DNA cellbooster免疫后,可 诱导中等滴度、针对其天然表位的IgG2a和IgG1抗体产生.结论:不同免疫方案可诱导针对HAb18GEF不同表位、不同滴度的 多克隆抗血清,为淘筛针对其不同表位的多样性抗体奠定了基础.     

抗γ-精浆蛋白人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库的构建及导向筛选

目的:建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库,筛选抗γ-精浆蛋白(γ-sm)人源性抗体轻链。方法:PCR扩增前列腺癌患者外周血淋巴细胞人抗体全套轻链基因,克隆人含鼠源抗γ-sm抗体Fd基因的pComb3X噬粒中,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库。通过稀释滴定、限制性酶切等分别对库容、基因重组率和多样性进行鉴定。以M13K07辅助噬菌体超感染,利用纯化的γ-sm对杂合库进行筛选,对筛出的阳性克隆进行功能检测。结果:构建了库容量为1．2×107CFU、重组率为90％、多样性好的人-鼠杂合噬菌体抗体库。ELISA检测出2个强阳性克隆,Western blot确证为抗γ--sm的人-鼠杂合Fab,竞争ELISA显示其表观亲和力约为亲本鼠抗体亲和力的71．8％。DNA测序显示筛到的人源轻链可变区基因属IGKV4-1*01胚系家族。结论:成功得到人源性抗γ-sm抗体轻链,为进一步获得全人源化抗体奠定了基础。     

大肠癌靶向治疗临床试验的研究进展

针对大肠癌不同分子靶标的治疗方案已相继进入临床试验阶段，有些已显示出较好疗效。靶向抑制EGFR单抗C225、ABXEGF和EMD7200是迄今最有治疗前景的药物，前者FDA已批准上市，后两者正处在临床Ⅰ、Ⅱ期阶段；靶向抑制EGFR表达的小分子药物EKB569、ZD1839、CI1033等的初期临床疗效还不明确，其与化疗药物联用的疗效均需进一步观察。靶向阻断Ras/Raf、细胞周期信号通路的小分子药物R115777、BAY439006、Flavopiridol等的单药疗效均不明显，其与化疗药物联用疗效还在观察之中。靶向抑制VEGF的Bevacizumab是FDA批准上市的另一个治疗大肠癌的单抗药物；靶向抑制VEGF或VEGFR的小分子化合物PTK/ZK、Thalidomide、SU5416等单药临床疗效一般，但其与化疗药物联用的疗效值得期待。其他针对MMPs、COX2、mTOR、泛素蛋白酶等靶点的小分子药物的单药治疗或联合治疗的疗效还在观察之中，现在难以定论。     

抗人大肠癌抗体CAb-1 Fab基因的克隆、表达和鉴定

目的:从杂交瘤细胞中克隆mAb CAb-1所编码Fab抗体基因,并在大肠杆菌中进行表达和鉴定.方法:采用RT-PCR方法,扩增mAb CAb-1的Fd片段和全长κ链基因,分别克隆到T载体后进行序列测定和分析.依次亚克隆两个基因到噬粒pComb3中,去除该载体上的gIII基因,构建成分泌表达载体Fd-L/pComb3.转化XL1-Blue E.coli菌株,IPTG诱导表达.采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性.结果:克隆了大肠癌mAb CAb-1的Fab基因,并在E.coli中获得表达.产物CAb-1 Fab具有与大肠癌细胞株SW480特异结合的活性.结论:成功构建了在E.coli中表达抗人大肠癌mAb CAb-1的小分子单价Fab抗体的载体.     

医学本科生细胞生物学双语教学调查评价

目的总结对医学本科生开展细胞生物学双语教学的经验和方法。方法问卷调查及分类分析。结果①本科生公共英语水平均达到了接受双语教学的基本条件 ,专业英语水平表现出不均衡性 ,英语听力薄弱是多数学员存在的共同问题。②学员对教员的素质要求很高 ,期望教员具有丰富的专业知识和流利的口语。对课时比例、教材等具体教学手段 ,不同学员要求不同。③双语教学的教学效果基本上是理想的 ,但仍有许多地方需改进 ;双语教学成功与否关键在于教师备课及学员预习。结论必须大力提高教员素质与教学经验 ,因地制宜确定教学内容 ,强化学员对专业词汇和背景知识的学习