关节软骨组织工程种子细胞的优化获取

目的　优化关节软骨组织工程种子细胞的体外获取方法。方法　分析不同代次体外单层培养幼兔关节软骨细胞接种密度与相对接种存活率的关系 ,并观察其细胞生长状况、形态特征及分化功能。结果　相同培养条件下 ,体外单层培养关节软骨细胞的相对接种存活率和生长活性与其接种密度呈正相关 ;同一代次适宜密度 [( 2～ 3)× 10 4 cm2 ]接种者的相对接种存活率和生长活性同高密度 [( 4～ 5 )× 10 4 cm2 ]接种者相近 ;传代培养 (第 2～ 4代 )细胞的相对接种存活率和生长活性相对高于原代培养者。结论　在相同培养条件下及一定传代次数内 ,适宜密度接种进行关节软骨细胞单层传代培养 ,可获取数量多、活性高的关节软骨组织工程种子细胞     

利用PLGA细胞支架再生人关节软骨的实验研究

目的：研究人关节软骨细胞在PLCA三维支架上的贴附和生长情况，利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法：制作PLGA三维细胞支架。分离培养成人关节软骨细胞，体外扩增后种植到PLGA支架中。在体外和裸鼠体内分别培养软骨细胞一支架复合物，分期终止培养，进行组织学染色、扫描电镜、Ⅱ型胶原免疫组织化学及cDNA探针原位杂交检测。结果：体外培养发现，软骨细胞支架材料内贴附生长良好，长期培养仍保持软骨细胞特性，棵鼠体内培养8周后可形成软骨样组织。结论：PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌软骨外基质，可作为软骨组织工程的细胞载体。利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化关节软骨。     

两种培养基对软骨细胞体外培养影响的对比研究

目的：研究不同培养基中兔关节软骨细胞生物学行为的差异，为软骨组织工程中软骨细胞的培养寻找最合适的培养基。方法：取3个月龄新西兰兔关节软骨消化获取软骨细胞，以相同密度分别用两种培养基(F-12、1640)进行培养，观察其形态、生物学行为、增生速度、特征性产物分泌量及黏附能力。分析两种培养基培养结果，对比其对体外培养关节软骨细胞的影响。结果：软骨细胞在1640培养基中贴壁、生长较快，细胞形态均一，特征性产物分泌旺盛。结论：在两种培养基中1640培养基更适合进行关节软骨细胞体外培养。     

关节软骨损伤组织工程修复的实验研究

目的：（1）研究不同体外培养时间软骨的生物学特性，探讨运用于软骨组织工程中软骨种子细胞的最适宜培养时间和条件。（2）应用组织工程技术探讨运用自体关节软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（3）应用组织工程技术探讨应用同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（4）研究修复关节软骨缺损的软骨细胞来源。方法：（1）取新西兰兔关节软骨细胞体外培养，观察软骨细胞的形态学变化，生长曲线，酸性粘多糖及胶原分泌情况。（2）建立关节软骨缺损模型，应用自体关节软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（3）应用同种异体软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（4）应用3H－TdR放射自显影方法，确定修复关节软骨缺损的细胞来源。结果：（1）体外培养第四代软骨细胞的增殖能力达到高峰，而第二代软骨细胞分泌基质能力最强。（2）自体或同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损，12周后缺损表面较平滑，与正常软骨界面愈合较好，MASSON三色染色显示胶原分布已较均匀， 骨细胞呈柱状排列，II型胶原在细胞周围阳性表达，而空白对照和材料对照组未见明显修复。（3）3H－TdR放射自显影方法证实修复软骨组织的细胞来源于体外移植细胞，软骨细胞植入体内早期仍进行有丝分裂，而在中后期软骨细胞以分泌基质为主，植入的细胞与周围软骨细胞间存在物质交换。结论：（1）软骨细胞在体外培养2－3周左右是作为软骨组织工程种子细胞的最佳时机。（2）自体或同种异体组织工程化软骨是修复关节软骨缺损的较好方法。（3）组织工程化软骨修复关节软骨缺损的细胞来源于体外移植的软骨细胞。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

目的探讨不同浓度软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质干细胞(BMSC)体外构建软骨的可行性.方法将体外分别培养扩增的猪BMSC与耳软骨细胞按不同比例混合(9:1,8:2),均以5.0×107/mL的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种作为阳性及阴性对照,以20%上述浓度的单纯软骨细胞接种作为低软骨细胞浓度对照.各标本于体外培养4周时取材,通过大体观察、组织学以及免疫组化等方法对新生软骨进行初步评价.结果各组细胞均与材料粘附良好.8:2共培养组及阳性对照组在体外培养4周时,外观已类似软骨组织并基本保持了材料的大小和形状,组织学显示有较连续的成熟软骨形成,免疫组化也均显示有大量Ⅱ型胶原分泌.9:1共培养组在培养过程中稍有缩小和变形,组织学上仅在培养物的边缘可见到连续的软骨样组织.阴性对照组明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝.低软骨细胞浓度组复合物明显变薄,只在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组.结论软骨细胞能够提供软骨微环境诱导BMSC成软骨分化并形成软骨,20%浓度的软骨细胞已能够达到良好的诱导效果.     

体外传代培养对关节软骨细胞成软骨能力的影响

目的　研究不同代体外培养关节软骨细胞成软骨能力 ,选择软骨组织工程最佳种子细胞。方法　将兔膝关节软骨消化分离出软骨细胞 ,传代培养至第 6代 ,每代细胞与模板支架材料Pluron icF 12 7混匀形成复合物 ,使细胞浓度达 5× 10 7/ml,将复合物注射于自体兔背部皮下 ,9周后取材 ,进行大体观察、新生软骨湿重与体积测量、组织学观察。结果　体外培养关节软骨细胞随传代次数的增加 ,形态从圆形逐渐向梭形转变。 1～ 3代软骨细胞成软骨能力最强 ,新生软骨的湿重与体积最大 ,组织结构与正常软骨相同 ;第 4代成软骨能力减弱 ,软骨基质分泌减少 ,新生软骨湿重和体积减小 ,与前 3代比较差异有显著性 ;第 5代仅形成分散于纤维组织内的软骨细胞团 ;第 6代则未发现有软骨样组织形成。结论　①在体外单层培养条件下 ,随传代次数的增加关节软骨细胞逐渐去分化 ,成软骨能力逐渐降低直到完全丧失。②前 3代软骨细胞均具备形成正常软骨的能力 ,都可用作组织工程的种子细胞 ,但传代培养的目的是使细胞得以最大限度扩增 ,因此第 3代关节软骨细胞是可被应用的最佳种子细胞     

自体软骨细胞立体培养修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的探讨自体软骨细胞立体培养构建的组织工程软骨修复关节软骨的效果。方法24只4～6月龄新西兰大白兔进行标记,首先在股骨下端建立动物软骨3.5mm缺损模型,获取软骨细胞进行体外培养、扩增,3代后获取足够细胞数量,制成1×108/ml细胞悬液,植入细胞载体Ⅰ型胶原海绵培养,两周后移植到自体3.5mm的软骨缺损面上,分别1、2、3个月处死观察。结果软骨细胞与细胞载体Ⅰ型胶原海绵有良好组织相溶性,两者培养形成自体组织工程软骨能完成关节软骨缺损修复。第1个月修复组织初步具备纤维软骨特征,第2个月初步具备透明软骨特征,第3个月修复组织具备透明软骨的生物学特性。结论细胞载体Ⅰ型胶原海绵与软骨细胞体外培养形成的组织工程软骨,能完成关节软骨的修复,修复组织为透明软骨。     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

退变腰椎软骨终板细胞生物学特征实验研究

目的 通过对人腰椎软骨终板细胞的培养,观察细胞的形态学和生物学性状,探讨影响其生物学行为的因素.方法 取腰椎退变和未退变终板软骨细胞,在加10%灭火胎牛血清的DMEM培养液中培养.建立体外终板软骨细胞培养模型,采取HE染色、绘制细胞生长曲线、Annexin-V/PI法、免疫组织化学染色、real-time PCR等方法,对细胞形态、活力、生长情况、凋亡、及软骨细胞基质合成进检测.结果 软骨终板细胞可以在体外进行培养;终板软骨细胞的生长情况及细胞表型类似关节软骨,有Ⅱ型胶原表达.退变软骨终板较未退变软骨终板活性及增殖能力降低.细胞凋亡增加,Ⅱ型胶原合成减少.结论 体外成功培养了人腰椎终板软骨细胞,并证明了退变软骨终板细胞凋亡增加,而活性降低,基质合成减少.该研究也为进一步研究终板软骨的生物学性状奠定基础.     

体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究

目的利用关节软骨细胞复合壳聚糖-磷酸甘油(chitosan/glycerophosphate, C/GP)凝胶,体外构建可注射性组织工程软骨,为微创方式治疗关节软骨缺损提供依据.方法以体外培养扩增的兔关节软骨细胞为种子细胞,以自制温固化可注射C/GP凝胶为支架,按5×107/ml细胞浓度复合体外培养.于倒置显微镜下观察细胞形态与分布,四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算培养1周时种子细胞存活率,培养4周时样本进行组织学及扫描电镜观察.结果软骨细胞在7:1(体积分数)C/GP凝胶中保持球形,细胞存活率95%以上;HE染色可见软骨较为典型的陷窝样结构、软骨囊及同源细胞群等现象;甲苯胺蓝异染及免疫组化Ⅱ型胶原染色呈强阳性.结论软骨细胞在C/GP凝胶中可存活并保持分泌软骨基质的功能,形成类软骨组织.温固化可注射性C/GP凝胶能作为软骨组织工程的载体材料.     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种骨胶原基质支架体外构建组织工程软骨

目的探讨复合应用胶原凝胶和骨胶原基质（BCM）支架作为软骨细胞载体体外构建组织工程软骨的有效性和可行性.方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种BCM支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）染色观察软骨组织形成情况.结果软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的软骨组织.结论胶原凝胶复合BCM支架可作为软骨细胞的载体体外构建组织工程软骨.     

改良以聚羟基乙酸为支架同种异体组织工程化塑形软骨的构建

OBJECTIVE: To improve the method for constructing allogeneic molded cartilage by means of tissue engineering techniques. METHODS: The chondrocytes from the rib and articular cartilage of infant rabbits were harvested by type II collagenase digestion, followed by in vitro cell culture for 3 to 4 passages. The chondrocytes were then prepared into cell suspension and seeded onto C -and O -shaped pre-molded polyglycolic acid (PGA) scaffolds form chondrocyte-PGA composites, which were subsequently cultured in vitro for 7 to 10 d before implanted subcutaneously into adult rabbits. Improvement was made upon conventional shaping and implantation procedures. Morphological observation and cartilage regeneration assessment were conducted at different time points following the implantation, in comparison with the observation by conventional shaping and implantation methods. RESULTS: During in vitro cell culture, the rate of viable chondrocytes in the final cell suspension was (92+/-2)% after well-controlled prolongation of digestion trypsin, similar to the viable cell rate (93+/-2) % by traditional procedures (P>0.05). Gross observation found milk-white, newly generated cartilage which had good flexibility 4 weeks after implantation, and after 8 weeks and later, the cartilage took on the color of porcelain-white. Histological examination showed a few inflammatory cells around the newly generated immature cartilage 4 weeks after implantation, and the inflammation abated when the newly generated cartilage acquired similar histological properties to that of the original cartilage 8 weeks postoperatively and later. After 16 weeks, no blood vessel or capillaries were visible within the new cartilage. CONCLUSION: The chondrocyte viability is not affected when the cells are treated with well-controlled prolonged digestion with trypsin during in vitro cell culture. Improved PGA scaffolds shaping and the implantation procedure facilitate the regeneration of the cartilage after the implantation of the composites.     

不同培养时间软骨细胞的生物学特性

目的 探讨软骨细胞在体外不同培养时间的生物学特性。方法 把罗骨细胞置盖玻片上２,观察不同培养时间细胞的形态学变化和增殖能力,应用阿新蓝和三色染色,观察细胞在培养过程中酸性粘多糖（ＧＡＧ）、和胶原分泌情况。结果 软骨细胞经体外单层培养,传代４～５代后,细胞形态逐渐由多角形变为俊形,基质分泌减少,ＧＡＧ和胶原染色变浅。结论 软骨细胞在体外培养３周左右是作为有组织工程的最佳种子细胞。     

瘦素对体外培养软骨细胞分泌NO和MMP-13的影响

目的:观察瘦素对体外培养兔关节软骨细胞分泌一氧化氮(NO)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的影响。方法:获取2月龄兔原代软骨细胞,培养、鉴定、传代。将第3代软骨细胞按实验要求种板培养,饥饿12 h后,以不同浓度瘦素单独或与 TNF-&agr;联合干预48或96 h,测定各组细胞上清液中NO及MMP-13的浓度。结果:不同浓度瘦素(5,10,15和20 μg/mL)组NO浓度与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05);而不同浓度的瘦素与TNF-&agr;(10 ng/mL)联合应用后,与TNF-&agr;组差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组并未测出MMP-13的存在,不同瘦素浓度(10,50和100 ng/mL)组测得MMP-13浓度在剂量主效应和时间主效应均有统计学意义(P<0.05)。结论:瘦素在体外能协同TNF-&agr;促进兔关节软骨细胞分泌NO和MMP-13。     

胰岛素铁硒传递蛋白促进组织工程软骨形成的作用

目的研究胰岛素铁硒传递蛋白(ITS)对组织工程软骨形成的影响。方法第2代猪关节软骨细胞单层培养或离心形成细胞聚集体,根据培养液不同分为2组:常规培养组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清)和ITS组(达尔伯克改良伊格尔培养基+体积分数10%胎牛血清+体积分数1%ITS),噻唑蓝(MTT)法评估2组软骨细胞增殖;细胞聚集体培养1、2、3、4周后取材,比较2组细胞聚集体大体形态、湿质量、组织学、Ⅱ型胶原(ColⅡ)免疫组织化学染色和软骨特异基因表达。结果 MTT检测显示第5、6、7天ITS组光密度值显著高于常规培养组(P<0.01);ITS组软骨细胞聚集体体积在培养3周和4周时明显大于常规培养组;ITS组湿质量培养4周时为(7.91±1.49)mg,明显高于常规培养组的(5.37±1.31)mg(P<0.05)。ITS组细胞聚集体甲苯胺蓝染色和ColⅡ免疫组织化学染色明显强于常规培养组;2组软骨特异基因SRY相关高迁移组盒子基因9、ColⅡ表达相当,ITS组Ⅹ型胶原表达减弱,核心蛋白和Ⅰ型胶原表达增强。结论 ITS通过促进软骨细胞增殖和细胞外基质分泌可更好地促进组织工程软骨形成。     

松质骨骨基质明胶复合软骨细胞构建组织工程软骨

目的 观察软骨细胞在同种异体松质骨骨基质明胶(BMG)上的生长、增殖和分化,探讨用松质骨BMG与软骨细胞体外构建组织工程软骨的效果.方法 分离1月龄兔关节软骨细胞,扩增后种植在松质骨BMG上体外构建组织工程软骨.于1、2、4、6周取材进行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学及透射电镜观察.结果 软骨细胞在BMG上生长良好,分泌蛋白聚糖和胶原.随培养时间延长,细胞增殖,松质骨BMG空隙内细胞数量增多,软骨陷窝形成,基质分泌增强.培养6周时软骨细胞在BMG表面及孔隙内形成软骨样组织,免疫组织化学染色显示细胞周围基质富含Ⅱ型胶原,分布均匀:透射电镜显示软骨细胞超微结构正常,细胞周围有大量基质产生.结论 同种异体松质骨BMG可以促进软骨细胞的生长增殖,维持软骨细胞的分化表型;在体外成功构建了组织工程软骨,它是一种较好的软骨组织工程支架材料.

Abstract：

Objective To evaluate the use of cancellous bone matrix gelatin (BMG) combined with chondrocytes in constructing tissue-engineered cartilage by observing the growth, proliferation and differentiation of chondrocytes on allogeneic cancellous BMG. Methods The articular chondrocytes isolated from a 1-month-old rabbit were multiplied to a monolayer and seeded onto cancellous BMG to construct tissue-engineered cartilage in vitro during a period of 6 weeks. Samples were taken from the construct after 1, 2,4, and 6 weeks of culture and evaluated by histology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). Results The chondrocytes excreted matrix proteoglycan and collagen on cancellous BMG. With the prolongation of the culture time, the cells proliferated in the construct and the cells in the lacunae increased. Numerous chondrocytes were present the central region of the cancellous BMG and surrounded by extracellular matrix. By 6 weeks of culture, the BMG was covered with 15-20 layers of chondrocytes and cartilaginous tissue occurred in the pores throughout the cancellous BMG. Immunohistochemical staining showed rich and evenly distributed type Ⅱ collagen around the chondrocytes, and TEM revealed an ultrastructure of the chondrocyte similar to that of native chondroctyes, with abundant extracellular matrix produced around the cells. Conclusion Tissue-engineered cartilage can be constructed in vitro using allogeneic cancellous BMG combined with chondrocytes. Allogeneic cancellous BMG serves as a good scaffold material for tissue-engineered cartilage to promote the growth and proliferation of the seeded chondrocytes and allows maintenance of the differentiation phenotype of the cells.     

Genistein对体外培养兔软骨细胞一氧化氮表达的影响

目的：观察受体酪氨酸激酶抑制剂genistein对体外培养兔软骨细胞一氧化氮（NO）表达的影响。方法：兔膝关节软骨细胞传代培养,应用不同浓度genistein干预1、2、3、4天后,通过亚硝酸盐测定检测培养上清液NO表达水平。结果：形态学、甲苯胺蓝染色显示3代以内体外培养软骨细胞保持细胞表型的稳定。在genistein干预后上清液中NO水平下降,下降水平与genistein干预浓度和时间相关。结论：体外培养兔软骨细胞三代以内的细胞具有较好的活性,genistein能有效降低兔软骨细胞NO的表达水平。     

Serum-free media for articular chondrocytes in-vitro expansion

Background In vitro chondrocyte expansion is a major challenge in cell-based therapy for human articular cartilage repair.Classical culture conditions usually use animal serum as a medium supplement,wh...     

Characterization of Human Primary Chondrocytes of Osteoarthritic Cartilage at Varying Severity

Background  There is a difficulty in evaluating the in vivo functionality of individual chondrocytes, and there is much heterogeneity among cartilage affected by osteoarthritis (OA). In this study, in vitro cultured chondrocytes harvested from varying stages of degeneration were studied as a projective model to further understand the pathogenesis of osteoarthritis.

Methods  Cartilage of varying degeneration of end-stage OA was harvested, while cell yield and matrix glycosaminoglycan (GAG) content were measured. Cell morphology, proliferation, and gene expression of collagen type I, II, and X, aggrecan, matrix metalloproteinase 13 (MMP-13), and ADAMTS5 of the acquired chondrocytes were measured during subsequent in vitro culture.

Results  Both the number of cells and the GAG content increased with increasing severity of OA. Cell spreading area increased and gradually showed spindle-like morphology during in vitro culture. Gene expression of collagen type II, collagen type X as well as GAG decreased with severity of cartilage degeneration, while expression of collagen type I increased. Expression of MMP-13 increased with severity of cartilage degeneration, while expression of ADAMTS-5 remained stable. Expression of collagen type II, X, GAG, and MMP-13 substantially decreased with in vitro culture. Expression of collagen type I increased with in vitro cultures, while expression of ADAMTS 5 remained stable.

Conclusions  Expression of functional genes such as collagen type II and GAG decreased during severe degeneration of OA cartilage and in vitro dedifferentiation. Gene expression of collagen I and MMP-13 increased with severity of cartilage degeneration.

     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外软骨形成的实验研究

目的探讨软骨细胞与骨髓基质细胞(BMSC)共培养体外构建软骨的可行性,以阐明软骨细胞能否诱导BMSC向软骨细胞分化并形成软骨组织. 方法分别培养猪的BMSC与耳软骨细胞,将2种细胞按82(BMSC软骨细胞)比例混匀,以5.0×107/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸支架(PGA/PLA,直径9 mm,高3 mm)作为共培养组,相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC分别接种于相同支架作为阳性对照及阴性对照,1.0×107/ml(相当于共培养组中软骨细胞数)的单纯软骨细胞接种作为低浓度软骨细胞对照.每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200 μl.全部标本均于体外培养8周后取材,通过大体观察、湿重测定、蛋白多糖含量测定、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生软骨进行评价. 结果各组细胞均与材料支架黏附良好.共培养组及阳性对照组(软骨细胞组)体外培养8周后均形成了成熟的软骨组织,并基本保持了复合物初始的大小和形状,2组新生软骨外观及组织学特征基本相同,免疫组织化学也显示2组均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原.定量测定结果表明,共培养组的平均湿重和蛋白多糖含量均达到阳性对照组的80%以上.阴性对照组(单纯BMSC组)在体外培养过程中逐渐皱缩变形,仅在组织块边缘的局部区域形成了极少量软骨样组织.低浓度软骨细胞组在体外培养过程中也出现了明显的皱缩变形,新生软骨平均湿重仅达到阳性对照组的40%左右,组织学显示只在局部形成了不连续的软骨组织. 结论软骨微环境在BMSC成软骨分化及体外软骨形成中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导BMSC向软骨细胞分化并促进BMSC体外软骨形成.