应用同种异体组织工程软骨修复关节软骨缺损观察

目的用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体支架在体外进行软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,利用此人工软骨修复关节软骨缺损。方法取2周龄兔关节软骨,经消化、分离的软骨细胞体外培养。培养第3周时,进行免疫组织化学分析;利用培养3周的人工软骨对异体成兔的关节软骨损伤进行修复。结果培养物内软骨细胞均得到较好存活,形成软骨陷窝,出现同源性细胞簇,分泌软骨基质;DNA和糖胺多糖(GAG)在培养第24天时达到高峰,分别为(5.18±0.19)、(214.3±2.8)μg/块;对异体关节软骨损伤的移植修复结果良好,在12周时,移植物与周边正常组织结合紧密、齐高,移植的软骨细胞趋于柱状排列,为透明软骨组织。结论用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可构建较大的组织工程软骨,能较好地修复同种异体关节软骨缺损。     

人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养

背景：皮肤真皮组织是皮肤损伤修复时除表皮基底层以外可形成表皮层结构的重要干细胞来源。目的：探索从人皮肤真皮组织中分离培养角朊干细胞样细胞的新方法。方法：将一定大小的成人腹部全层皮肤组织用Dispase过夜消化后去除表皮层结构,然后用0．1％I型胶原酶过夜消化,离心分离以获取真皮来源总细胞。将分离的细胞用含有体积分数1％N2,2％B27,20μg／L表皮生长因子和40pg／L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM／F12（1：1）无血清培养液悬浮后以低密度接种于培养皿进行培养。采用RT-PCR和免疫细胞荧光染色法对其进行分析。结果与结论：RT-PCR分析结果显示所分离的真皮细胞中含有表达Lgr5和Lirgl等特异基因的毛囊来源干细胞;免疫细胞荧光分析结果显示其表达细胞角蛋白8和细胞角蛋白14。在无血清条件下培养6d时,可观察到表达细胞角蛋白14和整合素α6的“铺路石”样细胞克隆。进行传代培养后P1细胞表达角朊干细胞标志物CD29、细胞角蛋白14和P63。传代培养至P3,4时大部分细胞分化,不能继续传代。结果证实,以无血清培养液结合低密度培养法可直接从人真皮组织中有效地培养增殖活跃、细胞角蛋白14和P63阳性的角朊干细胞样细胞。     

源于人躯干皮肤真皮的成纤维样细胞的间充质干细胞分化潜能

目的: 研究从人皮肤真皮组织中分离培养的成纤维样细胞向中胚层细胞分化的潜能,初步探讨其替代自体骨髓间充质干细胞(BMSCs)用于组织损伤和缺损修复的可行性。方法: 将一定大小的成人腹部全层皮肤组织分别用分散酶和Ⅰ型胶原酶消化,分离获得真皮来源总细胞。单层培养扩增的细胞在含有一定浓度N2、B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养液中进行悬浮培养,并收集培养液中悬浮存在的球状细胞聚集体(SDDSs),用含胎牛血清的培养液进一步单层扩增细胞。以免疫细胞荧光法分析细胞和鉴定细胞的分化特性。结果: 真皮中分离的一些单个细胞在无血清培养液中分裂增殖形成SDDSs;在含血清的单层培养条件下,从SDDSs分离培养的细胞增殖活跃,细胞表达间充质干细胞标志物CD90、CD105和波形蛋白;分别向骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞诱导分化后,呈现类似于BMSCs分化特点,分化的细胞呈茜素红、番红O和油红O特殊染色阳性反应,但真皮细胞分化形成的软骨细胞番红O染色弱于骨髓干细胞来源的软骨细胞。结论: 结合无血清培养和有血清培养法,可从人真皮组织中分离培养具有向软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞分化潜能的细胞,此细胞将有望替代BMSCs用于临床组织损伤修复的再生治疗。     

应用自体软骨细胞移植物修复关节软骨缺损

目的 通过体外扩增关节软骨细胞，构建软骨组织工程移植物，观察移植物对自体关节软骨损伤的修复作用。方法 由8周龄成年兔髌骨外侧缘获取关节软骨，分离软骨细胞，体外扩增后，与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合，制成软骨培养物，体外培养4d。用于对成兔自体关节软骨损伤的移植修复。结果 成年家兔关节软骨细胞体外单层培养至第2代时开始出现去分化现象，可利用生长因子抑制去分化；该移植物的移植修复效果良好，修复后12周移植物与周边正常组织结合紧密、齐高，细胞趋于柱状排列，已形成透明软骨组织。结论 利用体外扩增的方法能获得足够量表型良好的关节软骨细胞，当应用胶原-纤维蛋白为载体制备出软骨组织工程培养物后，能较好地修复自体关节软骨损伤。     

MiR-124通过调控Smad4促进C6胶质瘤细胞凋亡的研究

【立论依据】 胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。由于外科技术难以做到病理学上的全切除,术后复发率非常高。在前期实验中我们发现C6胶质瘤细胞miR-124含量显著低于与正常大鼠大脑组织,且转染miR-124 后,C6胶质瘤细胞数明显减少。我们应用microRNA靶基因信息软件查到smad4的mRNA与miR-124-3p有3个结合位点,smad4可能是miR-124的靶基因。由此推测miR-124可能通过抑制smad4的蛋白表达对胶质瘤细胞起作用。 【设计思路】 本实验以大鼠C6胶质瘤细胞为研究对象,通过人为转染miR-124,分析其对smad4蛋白表达的影响,并确定smad4为miR-124新靶基因,从而探索miR-124对促进C6胶质瘤细胞凋亡的新作用机制。 【实验内容】 (1)通过qRT-PCR检测正常大鼠大脑、C6胶质瘤细胞、转染后的C6胶质瘤细胞中miR-124的表达水平。(2)转染外源miR-124观察C6胶质瘤细胞的生长状态。(3)结合蛋白质印迹和TUNEL assay方法,比较分析miR-124转染前和后C6胶质瘤细胞凋亡差异。(4)通过qRT-PCR检测比较分析转染miR-124 前后C6胶质瘤细胞中smad4 mRNA的表达变化。(5)用蛋白质印迹检测转染miR-124前后的C6胶质瘤细胞中Smad4表达变化。(6)以siRNA-Smad4 抑制smad4基因的表达后,再转染 miR-124 mimic,通过蛋白质印迹和细胞荧光染色方法比较分析细胞增殖的变化。 【材料】 C6胶质瘤细胞,Lipo2000脂质体,miR-124 mimic,实时PCR仪,超净台,孵箱,相差显微镜,荧光显微镜,PCR相关试剂,蛋白质印迹相关试剂,TUNEL assay试剂盒,Smad4抗体等。 【可行性】 前期研究已证实人工转染miR-124后其细胞数明显降低,smad4的蛋白水平下调;通过microRNA靶基因信息软件查到smad4可能是miR-124的另一个靶基因;项目组成员已熟练掌握研究所需要各种实验技术;实验设备齐全,具有完成上述实验的基本仪器设备。 【创新性】 我们将证明:miR-124通过抑制smad4的蛋白表达,调控smad4,抑制胶质瘤细胞的增殖且促进死亡。已有研究表明miR-124通过抑制靶基因STAT3 的蛋白表达对胶质瘤起作用,但目前尚无关于miR-124与 smad4之间作用关系的报道。     

重组BMP7真核表达载体的构建及其对关节软骨细胞的转染

目的：构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,并探讨转染关节软骨细胞的脂质体和DNA的最佳比例及BMP7基因表达。方法：构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体。用脂质体将pcDNA3.1-BMP7包裹形成DNA脂质体复合物,转染家兔关节软骨细胞,G₄₁₈筛选。转染过程中确定脂质体浓度、脂质体与pcDNA3.1-BMP7质粒的比例。原位杂交、PCR、Western blotting测定BMP7表达。结果：构建了pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,脂质体与 pcDNA3.1-BMP7质粒最佳转染浓度为3 mL培养液中加10 μL脂质体和4 μg pcDNA3.1-BMP7质粒(2.5∶1);以400 mg·L^-1 G₄₁₈的正常培养液筛选28 d,BMP7为阳性表达。结论：在脂质体介导下,pcDNA3.1-BMP7转染家兔关节软骨细胞获得成功,且BMP7在该细胞中稳定表达。     

应用几丁质胶原网架构建组织工程软骨

目的：探索利用几丁质胶原网架构建组织工程人工软骨的方法。 方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化、传代培养后,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,将几丁质纤维网架浸入上述混合物中制成人工软骨培养物并在体外培养。将培养1周的组织工程培养物,植入同种异体动物皮下组织培养4周,观察组织工程软骨的形成情况。 结果：细胞在几丁质网架培养物中分布均匀,细胞多呈三角形或梭形,培养物体积收缩不明显,经体内培养存活的软骨细胞分泌Ⅱ型胶原,有血管和炎性细胞的侵入。结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合凝胶与几丁质纤维网架载体为支架植入软骨细胞以后,在体外和体内都可以培养构建出较大的组织工程软骨。     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

应用人胚软骨细胞修复关节软骨缺损的研究

目的了解应用人胚胎关节软骨细胞修复家兔膝关节软骨大面积深层缺损的效果,为临床上进一步应用人胚胎关节软骨细胞进行同种异体细胞移植的可行性提供佐证.方法将分离的人胚胎关节软骨细胞以天然胶原作为细胞外基质网架,进行体外三维培养1周后,植入家兔关节软骨大面积深层(5 mm×5 mm×4 mm)缺损处,对修复组织进行大体观察及组织学评估.结果移植术后12周,缺损部位平坦、光滑,已为类似关节软骨的半透明组织填充,修复组织与宿主关节软骨组织整合较好,界限模糊;移植术后24周,缺损表面为透明软骨填充,缺损深部的软骨下骨组织已经重建.结论人胚胎关节软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞用于修复关节软骨组织的缺损.     

体外重建组织工程关节软骨的实验研究

目的　用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行软骨细胞三维立体培养 ,构建人工软骨组织。方法　取 2周龄的新生兔关节软骨 ,经消化 ,将获得的软骨细胞与牛 型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合 ,制成软骨培养物并在体外培养。培养第 3周时 ,取材进行 HE、甲苯胺蓝染色和透射电镜检查。结果　体外培养 3周 ,培养物内细胞均存活 ,形成软骨陷窝 ,同源性细胞簇出现 ,并分泌软骨基质。透射电镜下可见丰富的粗面内质网和线粒体 ,及少量的高尔基复合体。结论　用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞 ,可构建较大的组织工程软骨