应用同种异体组织工程软骨修复关节软骨缺损观察

目的用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体支架在体外进行软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,利用此人工软骨修复关节软骨缺损。方法取2周龄兔关节软骨,经消化、分离的软骨细胞体外培养。培养第3周时,进行免疫组织化学分析;利用培养3周的人工软骨对异体成兔的关节软骨损伤进行修复。结果培养物内软骨细胞均得到较好存活,形成软骨陷窝,出现同源性细胞簇,分泌软骨基质;DNA和糖胺多糖(GAG)在培养第24天时达到高峰,分别为(5.18±0.19)、(214.3±2.8)μg/块;对异体关节软骨损伤的移植修复结果良好,在12周时,移植物与周边正常组织结合紧密、齐高,移植的软骨细胞趋于柱状排列,为透明软骨组织。结论用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可构建较大的组织工程软骨,能较好地修复同种异体关节软骨缺损。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

胶原酶在腰间盘突出症中的变化及意义

目的：研究胶原酶在腰间盘突出症中的变化，探讨腰间盘突出症发生的机理。方法：共收集健康成人腰间盘２０例，腰间盘突出症害出髓核３１例，提取并测定其原酶，结果：突出髓核中胶原酶活性低于正常组（Ｐ〈０．０５），突出髓核中胶原含量升高与胶原酶活性降低呈平行关系，结论：骨核胶原酶活性降低与腰间突出症的发生相关。     

皮肤角质形成细胞的无血清培养方法

目的探索建立少量成年自体皮肤角质形成细胞体外无血清培养体系,为自体组织工程皮肤的构建与移植奠定物质基础。方法:无菌条件下,取2cm×2cm 兔耳皮肤组织块,Dispase 消化,分离真表皮,表皮以胰蛋白酶+EDTA 消化获得角质形成细胞,以含钙和不含钙的角质形成细胞培养液(K-SFM),按不同细胞密度接种于24孔板,观察细胞生长状况;免疫组化鉴定,MTT 法测定不同血清浓度对角质形成细胞增殖分化的影响。结果:在适当的 Ca~(2+)浓度下,少量自体角质形成细胞能够在无血清培养液 k-SFM 中培养扩增,最多可传4～6代。添加血清后可明显加速细胞分化。结论:无血清培养体系适用于少量成年自体角质形成细胞的体外连续培养扩增,培养的细胞可用于自体组织工程皮肤的构建。     

HPLC测定更年安胶囊中大黄素的含量

目的：建立更年安胶囊中大黄素含量的高效液相色谱法(HPLC)测定方法,为工业生产的质量控制提供依据。方法：采用HPLC测定更年安胶囊中大黄素含量,具体条件为：Shimpack VP-ODS C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) 色谱柱,甲醇-0.1%磷酸水溶液(77∶23)为流动相;检测波长为254 nm,柱温为40℃。结果：大黄素在0.04～0.32 μg范围内有良好线性关系,回归方程为Y=1 060+2 513 102X,r=0.999 1,平均回收率98.6%,RSD为1.88%（n=6）;以精密度实验、稳定性实验和重复性实验考察的RSD分别为0.86%、2.33%和1.88%。结论：HPLC测定更年安胶囊中大黄素含量方法可靠,简单可行,可为控制更年安胶囊的内在质量提供科学依据。     

软骨细胞外基质对生长板软骨构建的影响

观察了各种软骨细胞外基质对骺板软骨体外构建的影响。证实了胶原、蛋白多糖和透明质酸均显著地促进培养软骨细胞的生长,然而各种软骨细胞外基质促进软骨细胞增殖分化的作用并不相同。从组织学可观察到,胶原蛋白明显地促进软骨细胞的肥大化;而蛋白糖和透明质酸抑制成熟期软骨细胞向肥大期转换。     

重组pcDNA3．1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的：将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中，观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。 方法：实验于2003-08／2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只，兔膝关节软骨切碎后取2．0-2．5kg软骨组织，进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物，复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418的正常培养液筛选转pcDNA3.1-BMP7质粒μg400mg／L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞，显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d，分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。 结果：①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况：家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶／Ⅱ型胶原酶进行消化，能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h，部分细胞开始贴壁生长，72h后分裂增殖，7d时细胞融合率为90％～100％。贴壁初期细胞呈圆形或三角形，以三角形为主，每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况：转染后的软骨细胞用G418筛选，4d转染效率约15％，阳性克隆细胞七八天融合率约为90％。G418连续筛选28d，阳性克隆细胞仍然存活，细胞融合率为100％。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞，G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果：聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，结果在1．3kb处可见DNA条带，作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果：在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Western blot检测结果：可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果：转染7，28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光，未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果：转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7，28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色，未转染的软骨细胞未见BMP7表达。 结论：用脂质体将pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒转染至兔关节软骨细胞。BMP7在关节软骨细胞中获得表达，为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。     

应用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨

目的：利用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨，测定BMP7基因在构建的组织工程软骨中的表达，探讨与未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨的生物学差异。 方法：实验于2004—06／2005-01在哈尔滨医科大学附属第二医院临床药学药物研究所完成。应用转染重组pcDNA3．1-BMP7真核表达载体质粒并用G418筛选14d的阳性克隆软骨细胞，以胶原-纤维蛋白凝胶为支架，构建转BMP7基因组织工程软骨。以未转BMP7基因组织工程软骨作为对照，软骨细胞的接种密度为5&;#215;10^9L^-1。用甲苯胺蓝、苏木精-伊红染色对组织工程软骨培养物组织学分析；原位杂交法检测Ⅱ型胶原mRNA的表达；透射电镜观察组织工程软骨培养物的超微结构；原位杂交和免疫组化法测定体外培养物BMP7mRNA和蛋白的表达。 结果：①BMP7基因转染软骨细胞情况：G418筛选7d时大量细胞死亡，约30％的细胞存活，且贴壁生长。G418连续筛选14，28d均有阳性克隆细胞生成，贴壁生长率100％，存活的阳性克隆细胞为转染成功的软骨细胞。②组织工程软骨培养物大体形态及显微镜观察结果：构建的组织工程软骨培养物呈浅粉红色胶冻样圆盘状，透明，体积约为16mm&;#215;16mm&;#215;3mm。显微镜下只能观察到呈圆形的浅层细胞。③组织工程软骨培养物组织学分析结果：组织工程软骨培养物体外培养7，14，28d，细胞周围有丰富的细胞外基质，转BMP7基因组织工程软骨培养物细胞基质较多，体外培养14d软骨细胞合成和分泌最为活跃。④组织工程软骨培养物Ⅱ型胶原表达mRNA原位杂交检测结果：软骨细胞核周围呈棕黄色，有mRNA表达。⑤不同培养时间下组织工程软骨培养物DNA含量的测定情况：DNA含量随着培养时间的推移逐渐增加，21d时达到高峰，转BMP7基因比未转染BMP7基因的组织工程软骨培养物DNA含量高（P〈0．05）。⑥不同培养时间下组织工程软骨培养物糖胺多糖含量的测定情况：转BMP7基因组织工程软骨培养物体外培养34d时糖胺多糖含量最高，且各时间点糖胺多糖含量均高于未转BMP7基因组织软骨培养物（P〈0．05）。⑦组织工程软骨培养物的超微结构观察：与未转BMP7基因组织工程软骨培养物比较，体外培养7d，转BMP7基因组软骨培养物内软骨细胞细胞器发达，内质网、线粒体和高尔基体相对较丰富，细胞基质合成较旺盛；体外培养21d，转BMP7基因组织工程软骨培养物中软骨细胞粗面内质网仍较发达，线粒体和高尔基体相对减少，细胞基质合成能力减弱。⑧BMP7 mRNA表达原位杂交测定结果：体外培养7，14，21d，转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7 mRNA表达，而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7 mRNA。⑨BMP7蛋白表达免疫组化测定结果：体外培养7，14，21d，转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7蛋白表达，而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7蛋白。 结论：成功构建转BMP7基因组织工程软骨，其生物学特性优于未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨，作为移植物修复软骨组织缺损具有一定的可行性和优越性。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的：观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导人正常真皮成纤维细胞后，能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子，为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。 方法：实验于2001—06／2005—06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3．0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3．0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3．0-hVEGF165质粒大量制备（碱裂解法）-质粒纯化-质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EeoRⅠ和xbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只，无菌条件下取新生兔皮肤，尽量去除皮下组织，切成宽0．3cm小条块，Ⅰ型胶原酶消化，进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞，经G418筛选，获得阳性转染细胞克隆，并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平；原位杂交显示转基因细胞内VEGF165 mRNA的表达情况；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。 结果：①质粒酶切鉴定结果：提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5．4kb和0．57kb两个片段，与原质粒图谱符合，表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3．0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况：共进行15次转染试验，35孔（皿）均有G418抗性集落形成，表明pcDNA3．0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达：pcDNA3．0-hVEGF165转染成纤维细胞后，24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋、白表达，高达（3280&;#177;2054）ng／L，并于48，72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果：转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGF mRNA。G418应用2-4周后，可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆，筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEG FmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测：转染后成纤维细胞S期细胞比例增加，G1和G2期细胞减少，表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高。转染前为1．26％，转染后2d为2．64％，至12代时高达17135％。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察：细胞表面有较多微绒毛，核呈不规则形，胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体，沿膜可见一些膜包被颗粒。 结论：真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165成功导人家兔皮肤成纤维细胞，在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子，在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

芪冬颐心口服液对柯萨奇B3病毒感染的乳鼠心肌细胞的保护作用研究

柯萨奇B组病毒(CVB)是病毒性心肌炎(Viral My.ocarditis,VMC)的主要致病原,该病毒与心肌炎、心肌病的发生具有高度的相关性[1],但临床治疗VMC仍缺乏有效的抗病毒药物.本研究采用体外培养心肌细胞技术,选用CVB3作为致病病毒,观察芪冬颐心对培养心肌活细胞的直接作用,从而证明了该制剂对VMC心肌细胞的保护作用.