过氧化氢对关节软骨细胞过氧化损伤效应及中药黄芪干预实验研究

目的 观察过氧化氢对体外培养兔膝关节软骨细胞过氧化损伤效应及中药黄芪(astragalus)的干预作用,探讨黄芪抗氧化损伤作用机制.方法 兔膝关节软骨细胞原代培养,采用Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光法进行鉴定.分为正常对照组(正常组)、过氧化氢损伤对照组(损伤组)和过氧化氢损伤加黄芪干预组(黄芪组).损伤组采用终浓度 0.2mmol/L的过氧化氢制造体外软骨细胞过氧化损伤模型,黄芪组将终浓度分别为 0.02、0.1、0.5g/L的黄芪于过氧化氢损伤前 60min加入.测定各组细胞活力(MTT法)、细胞凋亡率(流式细胞术)、蛋白含量(考马斯亮蓝法)、培养上清液中丙二醛(MDA)含量(硫代巴比妥酸法)和SOD活性(邻苯三酚自氧化法).结果 与正常组比较,损伤组细胞活力显著降低、细胞凋亡率增加、蛋白含量下降、培养上清液中MDA水平显著上升、SOD活性和蛋白含量显著下降.黄芪组与损伤组比较,细胞活性显著升高、培养上清液中MDA水平显著降低、SOD活性和蛋白含量显著上升.结论 过氧化氢能造成体外软骨细胞显著的过氧化损伤,黄芪能抵抗体外软骨细胞过氧化损伤.     

瘦素对体外培养软骨细胞分泌NO和MMP-13的影响

目的:观察瘦素对体外培养兔关节软骨细胞分泌一氧化氮(NO)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)的影响。方法:获取2月龄兔原代软骨细胞,培养、鉴定、传代。将第3代软骨细胞按实验要求种板培养,饥饿12 h后,以不同浓度瘦素单独或与 TNF-&agr;联合干预48或96 h,测定各组细胞上清液中NO及MMP-13的浓度。结果:不同浓度瘦素(5,10,15和20 μg/mL)组NO浓度与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05);而不同浓度的瘦素与TNF-&agr;(10 ng/mL)联合应用后,与TNF-&agr;组差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组并未测出MMP-13的存在,不同瘦素浓度(10,50和100 ng/mL)组测得MMP-13浓度在剂量主效应和时间主效应均有统计学意义(P<0.05)。结论:瘦素在体外能协同TNF-&agr;促进兔关节软骨细胞分泌NO和MMP-13。     

T-2毒素对软骨细胞NO合成、iNOS表达的影响

目的:探讨T-2毒素对软骨细胞一氧化氮(NO)合成、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法:取胎儿软骨细胞体外培养,培养过程于培养液中加入不同浓度的T-2毒素(1~20μg/L)连续培养5d,用Griess重氮化法测定软骨细胞培养上清液中NO含量;用Western-Blot检测软骨细胞iNOS蛋白的表达;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测软骨细胞iNOS mRNA表达。结果:T-2毒素在1~20μg/L浓度范围内,能明显增加培养上清液中NO的含量,并使iNOS蛋白表达水平明显升高(P<0.05);当T-2毒素浓度达10~20μg/L时能引起iNOS mRNA表达水平提高(P<0.05),浓度越高,刺激作用越强。结论:T-2毒素使软骨细胞iNOS表达增强并使NO合成增多;T-2毒素引起的软骨细胞损伤与合成NO增多有关。     

乳兔关节软骨细胞的分离、培养及生物学特性的观察

目的：建立乳兔软骨细胞分离及培养的方法,观察软骨细胞在体外培养中的生物学特性.方法：采用两步消化法,将乳兔关节软骨进行分离、培养.采用苏木精伊红染色和甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定,用MTT法绘制生长曲线、并在倒置显微镜观察各代软骨细胞形态、通过免疫组化染色、逆转录聚合酶反应（RT PCR）法观察其生物学特性.结果：通过两步酶消化法,成功分离出乳兔关节软骨细胞,培养24 h后细胞贴壁呈短梭形.培养2周左右软骨细胞聚集似“铺路石”样.MTT法显示细胞生长曲线近似“S”形.甲苯胺蓝呈阳性结果,并随代数增加阳性结果呈减弱趋势.通过免疫组化染色和RT PCR显示随代数增加软骨细胞Ⅰ型胶原表达增强,Ⅱ型胶原表达减弱.结论：本研究采用两步酶消化法,成功从乳兔软骨内获取大量活性好、纯度高的软骨细胞,3代以内软骨细胞生长良好,并保持其生物学特性,适于软骨组织工程的应用.3代以后开始出现去分化现象.     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

兔关节软骨细胞的分离培养及生物学特征

目的 探讨兔关节软骨细胞分离培养的方法和生物学特性。方法 从4周龄新西兰白兔关节分离培养软骨细胞，倒置显微镜下观察原代及传代培养的细胞形态学变化，并计数绘制生长曲线。测定细胞冻存复苏后的存活率。用甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法了解葡萄糖胺多糖（GAGs），Ⅱ型胶原的合成情况并鉴定细胞。结果 成功建立体外培养兔关节软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定，冷冻复苏存活率为92％。结论 本文建立的体外培养关节软骨细胞的方法简单可行。体外培养的兔软骨细胞表型能保持3代稳定，具有良好的生物学活性，可用于实验研究，可经深低温冷冻保存。     

软骨细胞体外分离培养与鉴定的实验研究

目的探讨兔关节软骨细胞分离、培养和鉴定的方法，建立软骨细胞的体外培养体系。方法4周龄新西兰白兔采用机械-酶消化法，分离膝关节软骨细胞接种培养以及传代培养．倒置相差显微镜观察细胞形态，甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化对细胞进行鉴定。结果成功建立了体外培养软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原染色阳性。细胞传至5代后．出现“成纤维细胞样”。结论本研究建立了简单易行的软骨细胞分离、培养方法；初代、第2代、第3代细胞生长良好，适合于实验研究；软骨细胞5代培养后．细胞袁型发生改变。     

川芎嗪对IL-1β诱导的兔原代软骨细胞iNOS表达和NO合成的影响

目的观察川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的兔原代软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达及一氧化氮(NO)合成的影响。方法体外培养兔软骨细胞,用甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖,免疫荧光检测兔原代软骨细胞Ⅱ型胶原;用IL-1β10 ng/ml和(或)不同浓度(5、10、15、20μg/ml)川芎嗪共培养兔原代软骨细胞48 h后,RT-PCR和免疫组化检测iNOS基因及蛋白表达;用硝酸还原法检测细胞培养上清液NO的表达。结果软骨细胞呈三角形或多角形,蛋白多糖表达于细胞质中,Ⅱ型胶原主要表达于细胞质,少见于细胞核。与对照组比较,IL-1β单独作用软骨细胞iNOS和NO的表达显著增加(P<0.01);IL-1β和川芎嗪联合作用后,软骨细胞iNOS和NO的表达较IL-1β单独作用显著降低(P<0.05,P<0.01),但仍显著高于对照组(P<0.01)。结论川芎嗪能有效抑制IL-1β诱导兔软骨细胞iNOS的表达和NO的合成。     

兔下颌骨髁状突软骨细胞体外培养及生物学特性的研究

为探讨兔下颌骨髁状突软骨细胞的体外培养方法及其生物学特性，用胰酶及胶原酶联合消化法获取软骨细胞，并在ＤＭＥＭ培养基中进行原代及传代培养；通过形态学观察及免疫组织化学染色对软骨细胞的贴壁率、生长曲线及表型等细胞生物学特性进行了研究。结果：所获软骨细胞主呈多角形，第３代软骨细胞１２ｈ贴壁率达９５％，软骨细胞倍增时间约５５．１ｈ，６代以内软骨细胞的Ⅱ型胶原蛋白稳定表达。结果表明：本方法获软骨细胞具有稳定     

脂多糖诱导的人气道上皮细胞Caspase-1的表达研究

目的探讨脂多糖（LPS）诱导人气道上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）的表达情况。方法体外培养人气道上皮细胞,将其随机分为阴性对照组、LPS组及Caspase-1特异性抑制剂（Ac-YVAD-cmk）＋LPS组（简称cmk＋LPS组）。采用四氮唑盐（MTr）法测定各组细胞的增殖能力;实时荧光定量RT—PCR检测各组细胞Caspase-1mRNA的表达水平;Western—blot测定各组细胞Caspase-1蛋白的表达;ELISA法检测各组细胞上清液白介素1B（IL-1B）水平。结果3组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）;LPS组Caspase-1mRNA的表达水平较cmk＋LPS组和对照组增高,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）;LPS组Caspase．1蛋白的表达明显高于对照组和cmk＋LPS组,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）;LPS组IL．1B水平高于对照组和cmk＋LPS组,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NLRP3炎症复合体诱导的Caspase．1活化参与人气道上皮细胞LPS的致敏过程,并促进下游IL-1B的生成。     

汉黄芩素对脂多糖诱导的BV2细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响

[目的]探讨汉黄芩素对脂多糖(LPS)诱导的BV2细胞激活时所分泌的一氧化氮的产生以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.[方法]用10,100,500,1 000μg/L的LPS刺激小胶质细胞株BV2,并向LPS(100μg/L)中加入10,20,30μmol/L的汉黄芩素后再培养24h,采用Greiss法测定细胞外液所分泌的一氧化氮含量;应用Western-Blot及RT-PCR法分别检测iNOS蛋白和mRNA的表达.[结果]LPS高度激活BV2细胞,并且能使一氧化氮分泌增加,汉黄芩素呈剂量依赖性抑制一氧化氮的含量,同时抑制iNOS蛋白和mRNA的表达.[结论]汉黄芩素可有效抑制LPS激活的BV2细胞iNOS蛋白和mRNA的表达及一氧化氮的产生.     

体外非接触性共培养对MSC向软骨细胞诱导分化的实验观察

目的：探讨骨髓基质干细胞（MSCs）与软骨细胞体外非接触性共培养成软骨的可行性。方法：分离、培养、扩传兔MSCs及软骨细胞，MSCs以1×10^5个/ml接种于共培养板内孔，第1代软骨细胞以1×10^4个/ml接种于共培养板外空板。48h后将内孔插如外孔中，补充全培养基覆盖于MSC细胞层上。以相同密度MSC单独培养为空白对照，观察共培养7d和14d流式细胞仪观察MSC的Ⅱ型胶原蛋白变化情况。结果：实验空白组在7d和14d，Ⅱ型胶原蛋白均阴性表达，符合MSC特性。非接触共培养1周后，Ⅱ型胶原蛋白阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，具有统计学意义；非接触共培养2周后，Ⅱ型胶原蛋白也阳性表达，与空白对照比较，P〈0.01，同样具有统计学意义；实验14d组与实验7d组比较，P〈0.01，具有非常显著性差异。结论：软骨微环境在MSCs成软骨分化及体内软骨形成中具有重要作用，软骨细胞能有效地诱导MSCs向软骨细胞分化并促进MSCs体内软骨形成。     

氧化苦参碱对脂多糖诱导的RAW264.7细胞一氧化氮及其诱导型合酶表达的影响

目的：观察氧化苦参碱（OMT））对脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7细胞一氧化氮（NO）释放量及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法：采用LPS诱导RAW 264.7细胞建立细胞炎症反应模型。实验分组：空白对照组、LPS组（1μg/mL）、OMT组（100μmol/L）、LPS＋OMT小剂量组（20μmol/L）、LPS＋OMT中剂量组（50μmol/L）、LPS＋OMT大剂量组（100μmol/L）。采用Griess试剂法测定细胞培养液中NO释放量。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法测定RAW 264.7细胞iNOS mRNA的表达。结果：OMT显著减少LPS诱导的RAW 264.7细胞NO的释放（P〈0.05,P〈0.01）;同时减少LPS诱导的RAW 264.7细胞iNOS mRNA的表达（P〈0.05,P〈0.01）。结论：OMT可能通过抑制LPS诱导的巨噬细胞iNOS mRNA表达,减少NO的释放量而发挥抗炎作用。     

穿心莲内酯对巨噬细胞炎症因子表达的影响

目的研究穿心莲内酯对小鼠巨噬细胞氧化亚氮（NO）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）生成的影响。方法培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,分别加入脂多糖（lipopolysaccharide,LPS,终质量浓度1μg/mL）和不同浓度的穿心莲内酯（终浓度1、10、50μmol/L）进行干预,并设空白组和穿心莲内酯单独作用组作为对照。取培养24h细胞上清,用Griess法检测NO产量;用Elisa法检测TNF-α、IL-6浓度。结果与空白组比较,LPS明显促进了RAW264.7细胞NO、TNF-α、IL-6等炎症因子的生成;穿心莲内酯单独作用不影响炎症因子的表达,但穿心莲内酯能显著下调LPS诱导的炎症因子表达,与LPS组差异有显著性。结论穿心莲内酯可明显降低LPS诱导的巨噬细胞炎症因子表达,抑制炎症反应。     

肥大细胞对小鼠Lewis肺癌细胞生长周期的影响

目的探讨肥大细胞(MC)对Lewis肺癌(LLC)细胞生长的影响及其与MC释放的一氧化氮(NO)的关系。方法取对数生长期LLC细胞,于6孔培养板中培养6 h后,将其分为4组:LLC细胞单独培养组(LLC组)、MC和LLC细胞混合培养不加药组(MC+LLC组)、MC和LLC细胞混合培养加脂多糖(LPS)组(MC+LLC+LPS组)、MC和LLC细胞混合培养加N-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)和LPS组(MC+LLC+L-NMMA+LPS组)。用流式细胞仪分析癌细胞的周期分布。结果与LLC组比较,MC+LLC组S期LLC细胞显著减少(P<0.05);但2组G0/G1期LLC细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。与MC+LLC组比较,MC+LLC+LPS组S期LLC细胞显著减少(P<0.05),G0/G1期LLC细胞显著增多(P<0.05)。MC+LLC+L-NMMA+LPS组S期LLC细胞显著少于MC+LLC组(P<0.05)。MC+LLC+L-NMMA+LPS组S期LLC细胞多于MC+LLC+LPS组,但差异无统计学意义(P>0.05)。50、100 mg·L-1的MC对MC+LLC+L-NMMA+LPS组LLC细胞生长周期的影响差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MC能抑制LLC细胞的生长,其抑制效应可能与MC释放的NO有关。不同浓度的MC对LLC细胞周期的影响无显著差异。     

白附片含药血清对大鼠软骨细胞增殖影响的实验研究

目的：观察中药白附片含药血清对大鼠软骨细胞增殖的影响。方法：取1月龄的SD大鼠膝关节关节软骨Ⅱ型胶原酶消化,建立软骨细胞体外培养体系,甲苯胺蓝染色鉴定后,取体外培养第3代软骨细胞随机分为6组,分别加入不同浓度空白血清（5％、10％、15％）,不同浓度白附片含药血清（5％、10％、15％）,继续培养24、48、72h后,采用MTT比色法检测软骨细胞增殖的变化。结果：白附片含药血清组吸光度值（OD值）显著高于空白血清组,两组比较,差异有非常显著性意义（P＜0．01）。结论：白附片含药血清能有效促进大鼠膝关节软骨细胞的增殖。     

葡萄糖和胰岛素对SW480肿瘤细胞分泌IGF-1的影响

目的本实验模拟2型糖尿病病程中葡萄糖、胰岛素的浓度改变,研究不同浓度的葡萄糖、胰岛素对SW480肿瘤细胞分泌IGF-1的影响。方法体外培养SW480肿瘤细胞。依据培养液中加入葡萄糖、胰岛素浓度的不同,将实验细胞分为六组：0组（对照组）：RPMI1640细胞培养液;第1组：RPMI1640细胞培养液＋5mmol／L葡萄糖和5uIU／ml胰岛素;第2组：RPMI1640细胞培养液＋5mmol／L葡萄糖和125gIU／ml胰岛素;第3组：RPMI1640细胞培养液＋25mmol／L葡萄糖和125uIU／ml胰岛素;第4组：RPMI1640细胞培养液＋25mmol／L葡萄糖和5uIU／ml胰岛素;第5组：RPMI1640细胞培养液＋25mmol／L葡萄糖和1．25uIU／ml胰岛素。每个组设3个复孔,于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养48h,培养结束后,收集细胞培养上清,用ELISA方法检测IGF-1的浓度。结果在高浓度的胰岛素组（第2组、第3组,培养液中均含有125uIU／ml的胰岛素）IGF-1的浓度[（286．85±23．51）ug／L、（293．43±30．57）ug／L]高于对照组0组[（197．99±22．50）ug／L],差异有统计学意义（F=9．726,P〈0．01）;而第1、4、5组（培养液中分别含有5uIU／ml、5uIU／ml、1．25uIU／ml的胰岛素）IGF-1的浓度[（203．22±28．89）ug／L、（209．47±25．77）ug/L、（195．33±20．88ug/L）]与对照组0组相比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论高浓度的胰岛素能够上调SW480肿瘤细胞IGF-1的表达。     

游离脂肪酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的实验研究

目的 探讨游离脂肪酸（FFAs）对大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）的凋亡作用及凋亡机制。方法 用含有不同浓度（0、125、250、500μM）软脂酸的DMEM-F12培养肾小管上皮细胞（NRK-52E）,在24h、48h两个时段以原位末端标记（TUNEL法）检测细胞凋亡率,用硝酸还原酶法测定以上各组培养液中一氧化氮（NO）水平。在48h时段用免疫细胞化学法检测caspase-3表达水平。结果 随着软脂酸浓度的增高、作用时间的延长：①NRK-52E细胞的凋亡率逐渐增高,24h时三个软脂酸组按软脂酸浓度由低到高的凋亡率依次为（9.7±1.9）%、（14.2±4.5）%、（23.4±5.3）%,48h时为（16.2±3.7）%、（24.8±4.4）%、（35.4±5.7）%,与对照组相比均有统计学意义（P〈0.05）;②在凋亡率增高组的培养液中测得NO浓度也增加,差异均有显著性（P〈0.05）。③48h时各软脂酸干预组caspase-3阳性表达率增高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论 游离脂肪酸具有促进肾小管上皮细胞凋亡的作用,而这种作用与其自身在FFAs作用下产生过多的NO使caspase-3高表达有关。     

肿瘤坏死因子-α对体外培养成骨细胞一氧化氮水平的影响

目的:检测成骨细胞在不同质量浓度肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作用下一氧化氮(NO)的水平。方法:培养及鉴定成骨细胞,检测不同质量浓度TNF-α作用下成骨细胞培养上清液中NO的含量。结果:随着TNF-α质量浓度的提高,NO的水平逐渐升高;当TNF-α为10μg/L时NO水平最高,此后随着TNF-α作用时间和质量浓度的增加NO水平减少(P0.05~P0.01)。结论:单一的TNF-α可以诱导成骨细胞产生NO,但NO并不随着TNF-α质量浓度和时间的增加而持续增多。