荧光共振能量转移技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用

目的 利用激光共聚焦显微镜中的荧光共振能量转移(FRET)技术来验证整合素4结合蛋白(ITGB4BP)和P311间的相互作用.方法 分别构建能在哺乳动物细胞中表达ITGB4BP的绿色荧光融合蛋白ITGB4BP-EGFP和表达P311的红色荧光融合蛋白P311-DsRed的重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed,经酶切与测序鉴定正确后,共转染人胚肾293(HEK293)细胞48 h后,采用受体漂白方法(P311-DsRed),检测ITGB4BP和P311间的能量转移率(E)和相互间的作用距离(R).结果 重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed经双酶切鉴定正确,转染293细胞后经激光共聚焦显微镜观察能分别表达融合蛋白ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed,在细胞质和细胞核中存在着共定位,FRET检测结果显示其能量转移率为14%,两个分子间的作用距离为6.3 nm.结论 成功构建了ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中进行了表达后,利用FRET技术证实了活体细胞内ITGB4BP和P311间存在着相互作用.     

用FRET技术研究TLR4和MD-2的相互作用

目的 利用荧光共振能量转移（FRET）技术在活体细胞研究人Toll样受体（TLR）4与髓样细胞分化蛋白2（MD-2）的相互作用。方法 用PCR方法扩增TLR4编码序列和MD-2编码序列（不包括信号肽序列）并分别亚克隆入带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白和增强型黄色荧光蛋白表达载体（pECFP-C1-SP，pEYFP-C1-SP）中，重组质粒经酶切、序列鉴定分析后分别或共同转染HEK293细胞．用荧光显微镜观察荧光蛋白表达和分布情况，并用常规的方法和受体光漂白的方法对共表达青色荧光蛋白（CFP）-TLR4和黄色荧光蛋白（YFP）-MD-2的细胞进行FRET分析。结果 重组质粒在HEK293细胞中得到表达．仅转染pECFP／TLR4或pEYFP／MD-2的细胞可见青色或黄色荧光主要分布在胞质内，以核周较多：而共转染pECFP／TLR4和pEYFP／MD-2的细胞可同时检测到青色和黄色荧光，主要分布在细胞膜，同时胞质也有少量表达。无论是用常规的方法还是受体光漂白的方法，对共表达CFP-TLR4和YFP-MD-2的细胞进行FRET分析结果表明有FRET现象的发生．提示TLR4和MD-2有相互作用并形成复合物。结论 本研究为TLR4和MD-2在活体细胞中的相互作用提供了直接的证据。     

蛋白激酶C激活的荧光共振能量转移分析

目的当前,检测蛋白激酶C(PKC)激活的方法尚缺乏灵敏性或直接性,这里我们提供了一种新的直接而灵敏的方法——利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术来构建检测PKC激活的方法。方法将表达PKC激活的报告分子(CKAR)的质粒单独转染或与表达甲状旁腺素1型受体(PTHR1)的质粒共转染HEK293细胞,培养72 h后用激光共聚焦显微镜检测FRET的变化,并以此判断甲状旁腺素或佛波酯是否激活PKC。结果在只转染CKAR质粒的HEK293细胞,佛波酯降低了CKAR分子的FRET效率,并使青色荧光与黄色荧光的比值(C/Y)增加,而PTH(1-34)未能改变C/Y的值。在共转染了CKAR和PTHR1质粒的HEK293细胞,PTH(1-34)则使C/Y增加。结论PKC激活报告分子可用于检测PKC的激活,该方法也可作为PKC相关信号转导的实验平台。     

基于FRET技术MMP3生物传感器载体的构建和鉴定

目的: 探讨基质金属蛋白酶3(MMP3)生物传感器载体的构建,阐明MMP3在活细胞中表达的时空信息。方法: 构建定位于细胞膜表面的ECFP-MMP3-YPet生物传感器载体并进行鉴定;转染293T细胞24h后观察转染效率;加尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)刺激293T细胞,运用荧光共振能量转移(FRET)技术在共聚焦显微镜下观察MMP3生物传感器载体的荧光共振能量转移情况ECFP-MMP3-YPet biosensor。结果: 成功构建ECFP-MMP3-YPet biosensor;PCR和双酶切鉴定,MMP3-YPet约780bp,转染293T细胞后MMP3生物传感器在胞质较均匀分布,转染效率约40%。uPA刺激293T细胞后,胞质和胞核内FRET比值逐渐降低,约30min时达到最小值,随后恢复正常。结论: 基于FRET构建的MMP3生物传感器可以敏感而准确地监测活细胞中MMP3的表达情况。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-3与甲状腺激素受体α1的相互作用及其对甲状腺激素应答性基因转录的调节

目的 探讨胰岛索样生长因子结合蛋白 -3(IGFBP-3)与甲状腺激素受体α1(TRα1)之间的相互作用,及其对甲状腺激素应答性基因转录作用的调节.方法 采用谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验检测IGFBP-3与TRα1之间的相互作用;激光共聚焦显微镜观察两种蛋白在细胞中的分布;采用双萤光素酶实验检测过表达IGFBP-3对甲状腺素T3激活的生长激素启动子的影响.结果 谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验结果证明IGFBP-3 与TRα1在体内和体外都可以相互作用,激光共聚焦显微镜观察IGFBP-3和TRα1可以共定位于HEK-293细胞的细胞核.通过双萤光素酶实验检测到过表达IGFBP-3可以抑制甲状腺激素对生长激素启动子的激活作用(P<0.01).结论 IGFBP-3通过与 TRα1 相互作用抑制甲状腺激素应答性基因的转录,为IG-FBP-3 在核内发挥胰岛素样生长因子非依赖的作用提供了新的实验依据.     

蛋白激酶C激活的荧光共振能量转移研究

目的目前,临床上对于蛋白激酶C(PKC)激活的检测方法还缺乏一定的机制,检测过程中灵敏性或直接性不强,利用荧光共振能量转移技术能够有效的检测PKC激活。方法将检测的PKC激活报告分子单独转染或与甲状旁腺素1型受体(PTHR1)的质粒共转染,将这些细胞培养72 h后,利用激光共聚焦显微镜来检测它们的FRET的变化效果,从而用来辅助判断甲状旁腺素蛋白激酶C是否被激活。结果对于只转染CKAR质粒的HEK293细胞中,甲状旁腺素能够有效的降低CKAR分子的FRET效率,增加青色荧光与黄色荧光的比值,而在检测过程中PTH不能使C/Y值发生改变;而在共转染CKAR质粒的HEK293细胞中,PTH则能够有效的增加C/Y的值。结论 PKC激活报告分子能够用来检测PKC是否被激活,这种方法的检测能够为PKC有关信号的转导、实验等提供有效的平台。     

尿激酶型纤溶酶原激活物生物传感器的构建及鉴定

目的:构建含有增强型青色荧光蛋白-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)作用底物(substrate)-黄色荧光蛋白变体(YPet)融合蛋白的真核表达载体(ECFP-uPA substrate-linker-YPet),即uPA的生物传感器。方法:以Src-biosensor为模板,Primer Premier 5.0软件设计YPet引物,设计时5'端引入uPA底物序列及Linker,两端连接酶切位点及保护碱基。以pMD^TM-18T为中间载体,通过基因工程方法构建含有ECFP-uPA substrate-linker-YPet的真核表达载体。然后转染293T细胞,24 h后观察转染效率和融合蛋白表达情况,在荧光显微镜下,应用MetaFlour FRET 4.6软件观察并测量uPA生物传感器荧光共振能量转移(FRET)。结果:经过PCR和双酶切鉴定,克隆片段和酶切片段均与uPA substrate分子大小相符。细胞转染后转染效率达40%。免疫荧光检测,uPA生物传感器在293T细胞膜表达,用重组人uPA(rhuPA)刺激转染细胞可以检测到FRET现象。结论:成功构建uPA生物传感器,该生物传感器能够作为活细胞分子探针用于研究uPA的时空变化。     

信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体,为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据。方法采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体,用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞,观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达。结果DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确;酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确,TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上。结论所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的,pECFP-C1-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上,可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究。     

μ型阿片受体和催产素受体二聚化的研究

目的 探讨μ型阿片受体（MOR）和催产素受体（OTR）可否形成异源性受体二聚体。方法 采用免疫共沉淀（IP）和荧光共振能量转移（FRET）方法,检测在MOR和OTR质粒共转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和大鼠脑组织中是否存在MOR和OTR异源二聚体。结果 IP方法检测显示,在MOR和OTR质粒共转染CHO细胞及大鼠脑组织中可见MOR和OTR蛋白条带。MOR和OTR共转染CHO细胞FRET方法检测信号为阳性（FRET率均值为2.01）。结论 在MOR和OTR质粒共转染CHO细胞及大鼠脑组织中存在异源性MOR和OTR二聚体。     

信号肽-FRET荧光蛋白载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白(pECFP-C1-SP)和增强型黄色荧光蛋白(pEYFP-C1-SP)的质粒载体，为使用荧光共振能量转移(FRET)技术研究LPS在细胞膜上的受体识别机制提供依据。方法 采用点突变技术构建了带TLR4信号肽的载体，用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞，观察带信号肽载体和融合蛋白载体在细胞内的表达。结果 DNA测序证明所构建的带TLR4信号肽的载体正确；酶切和DNA测序表明融合蛋白载体的构建正确，TLR4信号肽可以使蛋白主要表达在膜上。结论 所构建的带信号肽的荧光蛋白载体是正确的，pECFP-C1-SP和pEYFP-C1-SP能够表达在细胞膜上，可有效地应用于膜蛋白相互作用的研究。     

聚乳酸荧光防伪纤维的制备及其性能

通过熔融纺丝法成功制备了聚乳酸荧光防伪纤维。分别采用DSC、XRD、纤维强度仪、荧光光谱仪、荧光显微镜等探讨了荧光粉含量对聚乳酸荧光防伪纤维的结晶结构、力学性能与荧光性能的影响,并利用激光共聚焦显微镜对防伪纤维进行了3D荧光分布模拟分析。研究结果表明：聚乳酸荧光防伪纤维在紫外光激发下,在530 nm处出现最强发射峰,纤维呈黄绿色荧光;随着荧光粉含量的增加,纤维的荧光强度增加,但荧光粉在基体中的团聚现象逐渐加剧,纤维的断裂强度逐渐降低;激光共聚焦显微镜可较好地模拟荧光防伪纤维中荧光粉的分布情况。     

BMP-7/GFP融合基因在人肾小管上皮细胞的表达与定位

目的 构建骨成形蛋白-7(BMP-7)／绿色荧光蛋白(GFP)融合基因，观察其在人肾小管上皮细胞的表达与定位。方法 将小鼠BMP-7全长eDNA与GFP融合，连接进入真核细胞表达质粒pEGFP-C1中，以脂质体介导的方法将重组表达质粒pEGFP-C1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞。采用Western blot方法检测BMP-7在肾小管上皮细胞的表达；激光共聚焦荧光显微镜观察BMP-7在人肾小管上皮细胞中的定位情况。结果 限制性酶切以及DNA测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7／GFP融合基因表达质粒。瞬时转染入肾小管上皮细胞BMP-7蛋白表达量较空载体转染组明显增加；GFP转染的细胞荧光均匀分布在整个细胞中，而pEGFP-C1-BMP-7转染的细胞荧光主要集中在细胞浆和细胞膜表面。结论 重组BMP-7／GFP融合蛋白具有GTP自发荧光的特性，且不影响BMP-7在细胞内的正确表达。     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

帕金森病相关基因α-突触核蛋白和PINK1对Nurr1的调节作用

目的 探讨帕金森病相关基因α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)和PTEN诱导的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)对转录因子Nurr1的调节作用。方法 利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的方法检测α-syn与Nurr1的相互作用。同时,在PINK1基因敲减的细胞模型中,通过双荧光素酶报告系统检测PINK1对Nurr1转录激活活性的调节作用。结果 FRET检测显示,CFP-α-syn与YFP-Nurr1之间发生了荧光共振能量转移的现象。其FRET效率大约为20.52%。提示α-syn与Nurr1之间可能存在直接的相互作用。对于PINK1基因敲减的细胞进行研究发现,在PINK1被抑制表达24 h或48 h后, Nurr1的活性显著下调。结论 以往研究提示α-syn可能是Nurr1的抑制因子。研究显示α-syn可能与Nurr1直接结合而抑制其活性。 而PINK1对Nurr1可能存在一个正性调节作用。因此,二者对Nurr1的调节可能存在一个相互协调、相互制约的关系。     

四种显微技术观测大鼠颌下腺细胞与丝素-壳聚糖体外共培养的形态学特点

目的 采用倒置显微镜、扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜(( laser scanning confocal microscopy,LSCM))技术对大鼠颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSMGs)与丝素-壳聚糖( silk fibroin-chitosan,SFCs)的体外复合培养进行形态学观察.为观测、评估种子细胞在三维支架的内部生长情况提供技术支持.方法 取0～8d龄SD大鼠的颌下腺,对大鼠颌下腺细胞进行原代培养、分离纯化并传代;用抗细胞角蛋白单克隆抗体( CK8)及淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源.选取传至第二代的对数生长期的RSMGs作为种子细胞,选取SFCs共混膜(5×5×2)mm作为支架材料构建组织工程化涎腺样结构.将种子细胞与支架材料复合培养并分别于倒置显微镜、SEM、荧光显微镜和LSCM下观察二者复合生长情况.结果 倒置显微镜可以直接观察活细胞与支架复合生长情况,方法简单易行.SEM可以较精确的展示细胞支架复合生长的表面超微结构.经过荧光染料的着色,荧光显微镜和LSCM都可以观察到支架上锚定的种子细胞.荧光显微镜可见细胞核的荧光信号均匀的分布在支架孔隙内.LSCM通过层扫描及三维重建技术对较厚的标本获取图像;并可以通过旋转图像,从不同角度观察细胞支架复合物的三维剖面或整体结构,得到更为准确的定位信息.结论 四种显微技术均可应用于RSMGs与SFCs体外共培养的形态学观测.LSCM的三维重建技术结合荧光染料标记可以较好地获得RSMGs与SFCs复合生长的情况,有着较广泛的应用价值.     

一种检测巨噬细胞内NADPH氧化酶活性的新方法

目的建立一种检测活细胞内ＮＡＤＰＨ氧化酶活性的新方法。方法用超氧离子物荧光探针ＨＥ标记巨噬细胞后,在激光扫描共聚焦显微镜下,用最适发射波长为５３０ｍｍ的检测器１检测巨噬细胞内ＨＥ的荧光强度变化。结果检测器１可检测单个和多个巨噬细胞内ＨＥ的荧光强度变化,ＰＭＡ刺激后巨噬细胞内ＨＦ荧光强度增强,ＮＡＤＰＨ氧化酶活性升高;地塞米松使巨噬细胞内ＨＥ荧光强度减弱,ＮＡＤＰＨ氧化酶活性降低：经地塞米松处理０．５ ｈ, ＰＭＡ刺激引起的巨噬细胞内 ＨＥ荧光强度增强幅度减小, ＮＡＤＰＨ氧化酶活性变化减小。结论激光扫描共聚焦显微术结合荧光标记技术可原位实时观察活细胞内ＮＡＤＰＨ氧化酶活性的变化。     

大鼠脊髓中神经生长因子受体TrkA的表达与分布

目的：检测神经生长因子受体TrkA在大鼠脊髓中的表达与分布。方法：通过Western blot检测TrkA在脊髓中的表达;通过免疫荧光组织化学,利用激光共聚焦显微镜检测TrkA在神经元中的定位。结果与结论：TrkA广泛分于脊髓各层神经元及灰质内,并且在神经元的胞体和树突中均有表达。     

针刺血清对培养海马神经元内质网活性的上调作用

目的:通过采用D-273内质网荧光分子探针来观察针刺血清调节内质网活性的作用,从而探讨针刺作用的细胞分子水平机理。方法:选用原代培养的9～11天的新生SD大鼠海马细胞,应用激光共聚焦显微镜动态扫描观察加入正常大鼠血清和电针"百会"、"足三里"、"曲池"、"三阴交"2周后的血清对培养的正常和模拟缺血缺氧海马神经元内质网活性的影响。结果:加入正常血清后对照和模型组海马神经元内质网荧光值均下降,而加入针刺血清后下降的荧光强度变化值减小。结论:针刺血清阻抑了神经元内质网活性的下降,显示针刺血清可能有提高海马神经元的内质网活性效应。     

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法 微型角膜刀制作兔角膜基质瓣；转染组用含rAAV－EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min，对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min，不同时间点(1、3、7、14、21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况，收集角膜，其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相，另一半固定后行HE染色。结果 转染组于转染第3天，体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达；7d达到高峰, 21d时仍有微弱表达。第7天 在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达。对照组角膜始终未见荧光表达。转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论 rAAV- EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞。为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。