Foxp3,Galectin-9,PD-L1在小鼠DC2.4细胞的表达

目的观察CD80,CD86,Foxp3,Galectin-9,PD-L1在小鼠DC细胞的表达,了解小鼠DC2.4细胞系的免疫学特性。方法用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养小鼠DC2.4细胞,光学显微镜观察细胞形态;流式细胞术检测CD80,CD86,Foxp3,Galectin-9,PD-L1在DC2.4细胞表达。结果光学显微镜示小鼠DC2.4细胞贴壁生长,呈树突、梭形及不规则形;流式细胞术检测DC2.4细胞CD80表达为91.04%±4.90%,CD86表达为98.54%±1.96%,Foxp3无或微表达,Galectin-9表达为14.33%±2.94%,PD-L1表达为98.80%±0.63%。结论小鼠DC2.4细胞是一个高表达CD80,CD86及PD-L1,低表达Galectin-9,无或微表达Foxp3的细胞系。     

自体角膜为载体Boston人工角膜治疗复杂性角膜盲

目的评价复杂性角膜混浊患者使用自体角膜做载体的BostonI型人工角膜植入的临床效果。方法回顾性病例研究。10例角膜盲患者（10眼）,术眼病变严重,经至少2名以上国内著名角膜病专家会诊。无法通过角膜移植复明。其中严重碱烧伤7眼,爆炸伤1眼,角膜内皮失代偿多次角膜移植失败1眼．双眼病毒性角膜炎角膜严重血管化1眼。其中9例为双眼盲。术前视力光感或手动。所有病例均一期完成手术,术中使用8．0mm或8．5mm环钻钻取患者角膜,用患者混浊病变的角膜为载体。安装Boston人工角膜。形成患者角膜．人工角膜复合体,复合体作为植片如传统角膜移植实行角膜植床和植片缝合固定,术中常规行晶状体摘除术。结果术后观察1-12个月,平均（5．7±3．8）个月,除1眼视力光感外,其余裸眼视力为0．1～0．8。手术并发症包括角膜植床出血人玻璃体腔2例,继发性青光眼2例,人工角膜后膜4例。所有术眼均无术后漏水并发症发生。结论人工角膜特别适合于穿透性角膜移植难于成功的角膜盲患者,而且是目前对严重角膜瘢痕血管化、眼睑或泪液功能不良患者有效的复明手段。我国角膜供体严重匮乏,用自体角膜为载体可作为部分BostonI型人工角膜植入手术的可行方案。     

玻璃体注药联合微创玻璃体切除治疗增殖性糖尿病视网膜病变的临床应用研究

目的：研究玻璃体腔注射抗新生血管生成药物联合23G玻璃体切除手术治疗严重增殖性糖尿病视网膜病变的临床疗效及并发症情况。方法采用回顾性非随机临床病例研究,共收集2014年5月—2016年5月严重增殖性糖尿病视网膜病变患者45例(45只眼)纳入研究,分析手术前后患者术眼的舒适度、局部水肿等主观自觉症状及最佳矫正视力、眼压、视网膜复位情况等客观指标,以及手术后并发症的发生情况。结果术后1周有30例(66.7%)患者的视力比术前提高,视力平均提高0.77±1.11。术后1个月有24例(88.9%)患者的视力比术前提高,视力平均提高1.29±0.97。术后发生再次玻璃体积血2例,发生孔源性视网膜脱离及高眼压各1例。结论玻璃体注射抗新生血管生成药物联合23G玻璃体切除手术安全、有效,能够改善多数严重增殖性糖尿病视网膜病变患者的视力预后。     

γ干扰素、白细胞介素4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中的作用*☆

目的：角膜移植免疫排斥反应是一个多因素参与的调节过程，近年来研究表明细胞因子在角膜移植免疫中起重要作用。实验拟验证γ-干扰素、白细胞介素4及CD25在大鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用。 方法：①实验于2006-10/2007-05在南方医科大学南方医院实验动物中心完成。选用Wistar大鼠24只，SD大鼠54只，实验方法符合动物伦理学要求。②将54只SD大鼠按随机数字表法分为3组，正常组6只，角膜移植组及地塞米松组均24只。后两组制备Wistar→SD角膜移植大鼠模型，受体选择右眼手术，供体提供双眼角膜。③用裂隙灯观察移植排斥情况；利用反转录-聚合酶链反应检测植片内γ-干扰素、CD25 mRNA的表达；应用酶联免疫吸附实验检测房水和血清中γ-干扰素、白细胞介素4含量；应用流式细胞术检测移植前后不同时相外周血淋巴细胞CD25的表达；术后第11天，应用免疫组织化学方法检测角膜CD4+，CD8+和CD25+ T细胞的表达。 结果：54只SD大鼠全部进入结果分析。①地塞米松组大鼠发生角膜移植排斥反应的时间长于角膜移植组(P=0.000)。②正常角膜植片无CD25、γ-干扰素mRNA表达，角膜移植组术后第11天角膜植片内γ-干扰素、CD25 mRNA的表达较地塞米松组增强(P < 0.05)。③角膜移植组角膜移植术后6，11 d血清γ-干扰素含量高于正常组（P < 0.05）；术后11 d含量高于术后6，24 d（P < 0.01）；地塞米松组术后6，11 d低于同期角膜移植组（P < 0.05）。④角膜移植组角膜移植术后6，11，24 d房水γ-干扰素、白细胞介素4含量均高于正常组（P < 0.05）；地塞米松组术后6，11 d均低于同期角膜移植组（P < 0.05~0.01）。⑤地塞米松组术后6，11 d外周血CD3+CD25+T/CD3+T比值低于同期角膜移植组（P < 0.05）。⑥术后第11天角膜移植组植片内CD4，CD8及CD25明显表达，地塞米松组CD4，CD8及CD25表达明显减弱。 结论：CD25、γ-干扰素和白细胞介素4在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用；促进白细胞介素4表达，抑制γ-干扰素及CD25产生，对降低角膜移植免疫排斥反应具有积极的作用。术后动态检测外周血CD25和γ-干扰素的表达有助于临床了解局部免疫反应程度并预测角膜移植排斥反应的发生。     

同种异体大鼠角膜移植物TRAIL及其受体DR4的表达与免疫排斥反应的关系

目的观察大鼠角膜移植术后角膜组织中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）及其死亡受体4（death receptor4，DR4）的表达情况，分析其与角膜移植免疫排斥反应的关系。方法实验对象分为移植组和对照组，移植组采用大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，术后每日观察排斥反应指数的变化，分别于术后不同时间点（7d、10d、14d）取角膜植片，采用免疫组织化学法（SABC法）检测TRAIL及DR4蛋白表达情况，并与对照组正常大鼠角膜组织TRAIL及DR4蛋白表达情况相比较。结果TRAIL及DR4主要表达于正常角膜上皮层，在基质层及内皮层有极少量表达；而移植组急性排斥期角膜植片各层TRAIL及DR4表达均增高，阳性表达主要集中在植片伤口附近的上皮层及浅层基质。结论与正常角膜相比，同种异体角膜移植术后急性排斥期植片各层TRAIL及DR4蛋白表达均增高，由此推测TRAIL及其受体DR4与角膜移植急性免疫排斥反应的发生发展有关。     

IL-1ra和CsA对大鼠角膜移植物TRAIL及DR4表达的影响

目的 比较研究白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)和环孢素A(CsA)对急性排斥期角膜移植物肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其死亡受体4(DR4)表达的影响.方法 建立大鼠同种异体穿透角膜移植模型,设生理盐水处理组、CsA治疗组和IL-1ra治疗组.免疫组织化学法检测急性排斥期角膜植片TRAIL及DR4的表达,并以正常大鼠角膜作为对照.结果 TRAIL及DR4在正常角膜中均有表达,主要分布于上皮层,基质层及内皮层有少量表达.急性排斥期角膜植片各层TRAIL及DR4表达均增高;与正常大鼠相比,生理盐水组TRAIL及DR4蛋白表达增高最为明显,CsA组次之,IL-1ra组TRAIL及DR4蛋白表达轻度增高.结论 IL-1ra、CsA均可通过调节TRAIL及DR4的表达抑制角膜移植排斥反应,且IL-1ra的效果优于CsA.     

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的:探讨血清1型腺相关病毒(rAAV1)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达及转染率。方法:采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒(rAAV1-EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型,用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h,再用此缝线间断缝合,将植片移植到大鼠角膜植床,术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果:按rAAV1-EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞。转染后3d,在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达;随MOI值的增高而增强,转染后7~9d达到高峰,此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率,MOI=103时是16.3%,MOI=104时是30.3%,MOI=105时是43.6%,MOI=106时是47.5%。rAAV1-EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论:rAAV1-EGFP可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞,是角膜基质细胞理想的报告基因。     

FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中的作用

目的 探讨转录因子FOXP3在角膜移植免疫排斥反应中的作用.方法 建立角膜移植动物模型.将57只SD大鼠随机分为A组(正常组)、B组和C组(术后0、2、 4、 6、8 d分别球结膜下注射生理盐水和地塞米松注射液).用裂隙灯观察移植排斥情况,RT-PCR检测植片内FOXP3 mRNA的表达,流式细胞术检测移植术前和术后不同时间外周血CD4 CD25 T及CD4 FOXP3 T淋巴细胞的表达.对各组角膜植片进行CD4、CD8、CD25和FOXP3表达的免疫组织化学检测.结果 C组发生排斥反应时间较B组明显延迟(P<0.05),B组术后第11 d角膜植片内FOXP3 mRNA的表达较C组明显减弱(P<0.05),对照组CD4 CD25 T/CD4 T的表达明显高于术前(P<0.05),而CD4 FOXP3 T/CD4 T的表达明显低于术前(P<0.05),植片中CD4、CD8和CD25表达明显,FOXP3有一定的表达.角膜移植排斥反应期间,地塞米松治疗组FOXP3和CD4 FOXP3 T/CD4 T的表达明显增强,CD4 CD25 T/CD4 T的表达明显减弱.结论 FOXP3在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用;增强植片内FOXP3的表达或增加外周血CD4 CD25 Tr淋巴细胞的含量有助于抑制角膜移植免疫排斥反应的发生.     

蛋白芯片技术监测大鼠穿透性角膜移植术后免疫排斥反应的发生

摘要：目的　利用蛋白质芯片技术双盲监测大鼠穿透性角膜移植术后免疫排斥反应的发生。方法 采用弱阳离子交换芯片(WCX2)结合表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术对穿透性角膜移植术后大鼠血清中表达的免疫排斥反应相关的低分子量差异蛋白进行筛选，并通过双盲法利用蛋白质芯片技术监测筛选结果。结果　质荷比0-20 000范围内，共检测到58个蛋白峰，其中6个蛋白质峰的表达有统计学意义。双盲法监测结果：血清中出现这6个蛋白质峰的大鼠角膜全部发生免疫排斥反应。结论 蛋白芯片技术能够筛选出灵敏度和特异性好的差异表达蛋白，为角膜移植排斥反应病情的治疗监测提供依据。     

J2对同种异体穿透性角膜移植模型大鼠CD4+和CD8+T细胞免疫功能的抑制

BACKGROUND: J2 takes functional domain (MHC CD4-D1/) of complex conjugate of CD4 molecule and MHC class II molecule as a target, and is a small molecule compound obtained by computer screening from a chemical data containing hundreds of thousands of organic compounds. In the previous study, J2 was used in mouse models of skin transplantation and keratoplasty by oral and intraperitoneal injection. Results verified that J2 could prolong the survival time of grafts, and suppress occurrence of rejection. To better play the role of a drug targeting and to reduce systemic toxicity, J2 will be further utilized in local treatment of keratoplasty rejection. OBJECTIVE: To investigate the inhibitory effect of new immunosuppressive agent J2 on CD4+ and CD8+ T cell immune functions in rat models receiving allogenic penetrating keratoplasty. METHODS: Allogeneic penetrating keratoplasty model was established using the adult female Wistar rats as donors and Sprague-Dawley rats as recipients. Group A: normal Sprague-Dawley rats were injected with 0.05 mL placebo subconjunctivally. Surgery rats were randomly divided into three groups. Group B: allograft rats were injected with 0.05 mL placebo subconjunctivally after autologous keratoplasty. Group C: allograft rats were injected with 0.05 mL placebo subconjunctivally. Group D: allograft rats were injected with 1% J2-nanosuspension 0.05 mL subconjunctivally. The distribution of T cell subsets in peripheral blood was detected using flow cytometry at 3 days, 1, 2 and 3 weeks after transplantation and compared among groups.  RESULTS AND CONCLUSION: There was no significant difference in total CD3+ T cells, CD4+ T cells, CD8+ T cells and CD4+/CD8+ in peripheral blood lymphocytes in group B at various time points. At 3 days and 1 week after surgery in group C, no significant difference in total CD3+ T cells, CD4+ T cells and CD8+ T cells was detected. At 1 and 2 weeks, the number of total CD3+ T cells, CD4+ T cells and CD8+ T cells increased, showing significant differences (P < 0.05). In group D, no significant hyperplasy was found in CD4+ T cells and CD8+ T cells at 1 and 2 weeks. The horizontal comparison of the same time point: the total CD3+ T lymphocytes of group D was significantly less than group C at 3 days, 1 and 2 weeks after operation (P < 0.05), whereas there was no significant difference at 3 weeks between the group D and group C. The number of CD4+ T lymphocytes in group D was less than in group C at 3 days and 1 week, but with no significant difference. The ratio of CD4+/CD8+ had no significant difference in group D compared with group C at 3 days, 1 and 3 weeks. J2 inhibits T lymphocyte proliferation and then inhibits T cell-mediated corneal allograft rejection.