监测TCR CDR3漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定

外周血95％ T淋巴细胞的TCR由α（胚系基因中AV、AJ、AC重排）、β（胚系基因中的BV、BD、BJ、BC重排）两条多肽链组成，不同V（D）J重排后，由V基因末端、J基因前端和V-J（或V—D和D—J）连接时中间插入的核苷酸序列，分别组成了特异的TCRα和8的CDR3基因谱型的多样性。一种CDR3序列代表一个T细胞克隆，测定特定CDR3序列出现的频率可以反映特定T细胞克隆扩增的程度和功能状态。     

应用斑点ELISA快速研究鸡卵黄抗体IgY的理化性质

目的应用斑点ELISA研究卵黄抗体的理化性质,使多克隆抗体的性质得以确定,为今后更好地研究和利用该抗体奠定基础。方法将制备的卵黄抗体用不同的方法(加热、酸、碱、酶等)处理后,再用斑点ELISA检测卵黄抗体的剩余活性。结果IgY有很好的耐热性,巴氏消毒不会使IgY失活。卵黄抗体在pH>5和<9的环境下,37℃3h后仍保持部分活性。卵黄抗体在室温存放4个月后仍保持部分活性。在pH<5时,胃蛋白酶能发挥作用,使卵黄抗体失去活性。结论IgY的高度稳定性,使得这一多克隆抗体的保存和运输较方便,有利于IgY的推广和使用。     

TNFR Ⅰ-IgGFc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及其在骨髓基质干细胞的表达

目的 构建携带人肿瘤坏死因子受体Ⅰ胞外区和IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(Ad-TNFRⅠ-IgGFc),体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨转TNFRⅠ-IgGFc基因的BMSCs治疗类风湿关节炎的可行性.方法 将TNFR Ⅰ-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,重组产生Ad-TNFRⅠ-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染培养至第2代BMSCs,利用RT-PCR、原位杂交、免疫组化方法,检测转染后细胞中TNFRⅠ-IgGFc的转录和表达.结果 成功构建了Ad-TNFRⅠ-IgGFc,感染性滴度达3×1010 TCID50/mL,转染后BMSCs在mRNA和蛋白水平均有TNFRⅠ-IgGFc表达.结论 构建的Ad-TNFRⅠ-IgGFc可有效转染BMSCs,并在其中高效表达,为将表达TNFRⅠ-IgGFc基因的BMSCs用于类风湿关节炎治疗的实验研究提供了基础.     

Jurkat细胞TCR基因重排对 BV CDR3的影响

目的探讨Jurkat细胞TCRBD2-BJ2基因重排对TCRβ链可变区互补决定区3（BV CDR3）可能产生的影响，为深入研究TCR基因重排奠定实验基础。方法RT-PCR扩增TCR BV26个亚家族CDR3区，结合TCR基因扫描（GeneScan）和基因测序技术，监测Jurkat细胞在增殖传代过程中以及在T细胞激活剂和超抗原SEA等刺激诱导后TCR BV CDR3谱系漂移及长度和序列变化。结果表达TCR BV8家族的单克隆细胞株Jurkat，在增殖传代过程中，以及经刺激诱导48或72h后，未监测到有TCR BV8以外的新的BV亚家族出现，BV8 CDR3长度和一级核苷酸序列也未发生变化。结论Jurkat细胞发生的TCR基因重排可能不引起TCR BV CDR3改变，因而对TCR BV CDR3区抗原识别特异性（即抗原特异性漂移）并未产生影响，但并不排除TCR发生改变的可能性。     

系统性红斑狼疮患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移和序列鉴定

目的 探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移，为SLE的免疫应答机制和个性化治疗研究提供基础。方法 采用免疫扫描谱型分析技术，分析5例正常献血员的CDR3分布特征及5例SLE患者PBMC中T细胞TCRβ链CDR3的优势利用情况，对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果 5例正常献血员PBMC TCR BV CDR3谱型均呈高斯分布，5例活动型SLE患者24TCR BV CDR3家族均出现不同的优势表达。对单／寡克隆性增生T细胞B链CDR3区基因进行测序，证实存在不同的CDR3序列。结论 SLE活动期外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系出现明显漂移，提示CDR3的选择性表达可能与SLE的免疫发病机理有关。特异应答的T细胞TCRCDR3序列的确定，将为SLE的发病机制研究和个性化治疗提供新的方法与手段。     

重组腺病毒Ad-HGF转染骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的 构建人肝细胞生长因子(HGF)重组腺病毒表达载体,体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),检测HGF基因表达,探讨转HGF基因的BMSCs治疗股骨头缺血性坏死(ANFH)的可行性.方法 利用RT-PCR方法,从共表达人HGF-Met的NIH3T3-H0细胞株中扩增人HGF cDNA,插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒共转染HEK293细胞,重组产生重组腺病毒Ad-HGF,PCR鉴定毒种正确后,在293细胞中扩增、纯化,TCID50法测定感染性滴度,然后感染BMSCs,RT-PCR、原位杂交、免疫组化检测转染后细胞中HGF的转录和表达.结果 成功制备了Ad-HGF,感染性滴度为2.6×1010TCID50/ml,转染后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达.结论 获得高表达人HGF基因的BMSCs,为其用于早期ANFH的治疗奠定了基础.     

肺结核患者外周血alpha/betaT细胞CDR3谱系研究

[摘要] 目的 探讨活动性肺结核患者外周血T细胞TCR α、 链CDR3 谱系漂移，为肺结核患者特异性T细胞免疫应答机制和免疫治疗研究提供基础。方法 采用基因扫描谱型分析技术，分析6例正常献血员及6例活动性肺结核患者PBMC中T细胞TCR CDR3谱型分布特征及患者TCR Vα和Vβ基因家族的优势取用情况，对克隆性增生T 细胞CDR3区进行序列分析。结果 6例正常献血员外周血中TCR 32 Vα、24 Vβ家族CDR3谱型均呈高斯分布（gaussian distribution），6例活动性肺结核患者出现不同Vα和Vβ家族优势取用，对部分单/寡克隆增生T细胞α、 链CDR3区基因进行测序，证实存在不同的CDR3序列。结论 肺结核患者活动期外周血T细胞TCR α、 链CDR3谱系出现明显漂移，提示CDR3的选择性表达与结核患者细胞免疫应答机制有关，优势取用Vα、Vβ家族T细胞TCR CDR3序列的确定，为肺结核患者特异性T细胞免疫治疗研究提供基础。     

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的:探讨血清1型腺相关病毒(rAAV1)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达及转染率。方法:采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒(rAAV1-EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型,用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h,再用此缝线间断缝合,将植片移植到大鼠角膜植床,术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果:按rAAV1-EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞。转染后3d,在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达;随MOI值的增高而增强,转染后7~9d达到高峰,此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率,MOI=103时是16.3%,MOI=104时是30.3%,MOI=105时是43.6%,MOI=106时是47.5%。rAAV1-EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论:rAAV1-EGFP可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞,是角膜基质细胞理想的报告基因。     

鼻咽癌细胞株体外诱导同种异体T细胞TCR VβCDR3谱型和细胞毒性分析

目的 用鼻咽癌细胞株CNE2体外负载同种异体树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导T淋巴细胞,使之活化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL),观察其体外特异性杀伤和克隆性增殖.方法 用GM-CSF,IL-4和TNF-α体外诱导健康志愿者外周血单核细胞,用CNE2负载,使之分化为成熟DC,流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征.在IL-2的作用下,用负载CNE2抗原的DC诱导自身T细胞生成特异性CTL.乳酸脱氢酶释放法检测其特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术分析T细胞的克隆性.结果 健康志愿者外周血单核细胞体外在GM-CSF,IL-4和TNF-α诱导下获得具有典型表型特征的成熟DC,其诱导的CTL对CNE2有明显的特异性杀伤作用;PBMC的TCR Vβ CDR3谱型呈高斯分布,而诱导后的T细胞部分家族出现优势表达.结论 负载鼻咽癌抗原的同种异体DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用,优势表达的TCR Vβ CDR3家族对鼻咽癌治疗有潜在的临床应用价值.     

肺结核患者外周血αβT细胞CDR3谱系研究

目的探讨活动性肺结核患者外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系漂移,为肺结核患者特异性T细胞免疫应答机制和免疫治疗研究提供基础。方法采用基因扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员及6例活动性肺结核患者PBMC中T细胞TCR CDR3谱型分布特征及患者TCRVα和Vβ基因家族的优势取用情况,对克隆性增生T细胞CDR3区进行序列分析。结果6例正常献血员外周血中TCR 32 Vα,24Vβ家族CDR3谱型均呈高斯分布(gaussian distribution),6例活动性肺结核患者出现不同Vα和Vβ家族优势取用,对部分单/寡克隆增生T细胞α,β链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论肺结核患者活动期外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达与结核患者细胞免疫应答机制有关,优势取用Vα,Vβ家族T细胞TCR CDR3序列的确定,为肺结核患者特异性T细胞免疫治疗研究提供基础。