"三阶段法"分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞

目的 探讨运用"三阶段法"分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞的效果.方法 取人脐带血4份,经过3个阶段(去除红细胞阶段、短暂培养阶段、持续培养阶段),以完全低糖DMEM(含20%胎牛血清)为培养基,纯化分离人脐血间充质干细胞.传代至第3代通过流式细胞仪和间充质干细胞诱导分化为成骨细胞进行鉴定.结果 4份人脐血中3份分离出间充质干细胞.分离培养的细胞经流式细胞仪检测不表达造血细胞的抗原(CD34-),表达间充质干细胞的抗原(CD29+、CD44+ 、CD105+),并能向成骨细胞方向分化.结论 "三阶段法"能够简便、有效地从人脐血中分离出间充质干细胞.     

大鼠骨髓间质干细胞多向分化研究

目的:分离和培养大鼠骨髓间质干细胞(BMSCs),并进行多向分化研究。方法:体外分离培养大鼠骨髓单个核细胞,以流式细胞仪检测其表面抗原(CD44、CD90、CD45)的表达。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞及成肝细胞的诱导。结果:通过流式细胞仪器检测表明培养的细胞为大鼠BMSCs。BMSCs经诱导后分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞及肝细胞。结论:大鼠BMSCs具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。     

心脉隆注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 探讨心脉隆注射液体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的可行性。方法 采用贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,免疫细胞荧光法检测诱导后巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果 流式细胞仪检测显示CD29、CD90阳性,CD34、CD45阴性。实验组诱导4、12h后Nestin阳性表达率分别为(81.0±1.6)%、(22.5±1.9)%,36h后Nestin阴性;诱导4h后NSE、MAP2阴性,12、36h后NSE阳性表达率分别为(73.5±2.2)%、(94.3±1.8)%,MAP2阳性表达率分别为(80.0±2.2)%、(96.4±2.8)%;诱导4、12、36h后GFAP阴性。结论 心脉隆注射液可在体外快速、高效地诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

人工模拟胰腺微环境诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素产生细胞

目的:探讨人工模拟胰腺微环境诱导下骨髓间充质干细胞是否可以转分化为胰岛素产生细胞,并评价其功能.方法:采集兔骨髓间充质干细胞,分为2组.实验组将胰腺碎片整合到镍包被的微载体中,重建胰腺微环境,进行细胞培养,对照组为同期培养的未经诱导的细胞.骨髓间充质干细胞在微环境中培养3～4周后,观察是否有胰岛样细胞团形成.ELISA法检测细胞悬液中胰岛素含量,荧光免疫组化检测细胞团胰岛素和C-肽蛋白的表达,荧光原位杂交(FISH)检测胰岛素和C-肽mRNA的表达,流式细胞仪检测分化的细胞在高糖环境下继续培养3周是否发生凋亡.结果:培养3～4周后倒置显微镜下观察到胰岛样细胞团.实验组基础相胰岛素分泌量为(308.50±14.54)mIU/L,在高糖刺激下为(414.30±28.94)mIU/L,2者相比,差异有统计学意义(t=5.68,P＜0.01);高糖刺激下实验组的胰岛素分泌量高于对照组的(5.21±1.04)mIU/L(t=34.60,P＜0.01).分化的胰岛样细胞团表达C-肽和胰岛素mRNA与蛋白.分化的细胞在高糖环境下继续培养3周未发生凋亡.结论:人工模拟胰腺微环境可以诱导骨髓间充质干细胞转分化为有功能的胰岛素产生细胞,有望替代胰岛细胞治疗糖尿病.     

非病毒诱导体系高效诱导脐带来源间充质干细胞向胰岛细胞分化

目的探讨非病毒法诱导脐带来源间充质干细胞(UC-MSC)向胰岛素分泌细胞分化的可行性,为胰岛细胞移植治疗糖尿病提供临床移植数量级的细胞。方法从人脐带分离间充质干细胞,体外分阶段诱导分化为胰岛细胞。采用RT-PCR方法比较胰岛细胞分化过程中转录因子foxa2、sox17、pdx1、ngn3、pax4、insulin和glut-2在诱导组和非诱导组中的表达水平;免疫荧光染色方法检测胰岛素和C-肽在诱导终末阶段细胞中的表达定位;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测胰岛素及C-肽的分泌以及细胞对葡萄糖刺激的反应性。结果诱导第1阶段末,诱导后细胞foxa2和sox17的表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05);诱导第2阶段末,诱导细胞pdx1、ngn3和pax4的表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05);诱导第3阶段末,诱导细胞的insulin和glut-2表达明显高于未诱导细胞(P均<0.05)。免疫荧光染色结果显示,胰岛素和C-肽均表达于诱导终末分化阶段的细胞,效率可达90%以上。ELISA检测结果显示,诱导第3阶段末细胞胰岛素总量为(346.3 739±32.5 149)μU/ml,明显高于未诱导细胞的(17.69...     

血管内皮生长因子C诱导骨髓间充质干细胞分化为淋巴管内皮细胞的研究

目的 研究骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化的潜能及条件,为淋巴管再生和重建提供理想的细胞来源。方法 分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原CD31、CD14、CD29和CD90。将纯化的骨髓间充质干细胞加血管内皮生长因子C(VEGF-C)50ng/mL诱导培养10d,Western-blot法与免疫荧光染色法检测细胞中淋巴管内皮细胞标记物Prox-1和LYVE-1的表达。结果 骨髓间充质干细胞呈现典型的梭形和旋涡状排列;经VEGF-C诱导后,细胞变短、呈多边形。流式细胞学显示,分离培养的骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD90呈阳性表达,CD31、CD14呈阴性表达;Western-blot检测显示,经VEGF-C培养诱导后,细胞明显表达淋巴管内皮特异性标记物Prox-1和LYVE-1;免疫荧光染色显示,诱导后细胞均明显表达Prox-1和LYVE-1,而未分化的骨髓间充质干细胞Prox-1和LYVE-1均不表达。结论 VEGF-C可以诱导骨髓间充质干细胞表达淋巴内皮细胞特异性标记物,促进其向淋巴管内皮转化。     

小鼠脂肪源干细胞的生物学特性及增殖特点

目的探讨脂肪源干细胞的生物学特性及其增殖特点。方法无菌条件下获取C57BL/6小鼠腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化并收集脂肪源干细胞(ADSCs),细胞传代至第3代(P3)后加成骨诱导液及成脂诱导液,对脂肪源干细胞进行定向成骨及成脂诱导,并分别行茜素红及油红O染色;流式细胞仪检测脂肪源干细胞表面免疫表型;测定脂肪源干细胞的细胞周期及其生长方式;CCK-8法测脂肪源干细胞增殖情况。结果小鼠脂肪来源的细胞在体外呈梭形生长,且能稳定传代;细胞在加入成骨及成脂诱导液后可定向分化成成骨细胞、成脂细胞;流式指标检测示:CD29高表达(91.4±0.95)%,CD34低表达(38.7±0.4)%;细胞增殖结果显示:细胞增殖旺盛,具有典型的对数期、平台期。结论小鼠脂肪组织来源的细胞是间充质干细胞;脂肪源间充质干细胞是具有多向分化潜能的理想种子细胞。     

胎胰蛋白促进人脂肪来源的间充质干细胞向胰岛素及C-肽阳性细胞的分化及细胞鉴定

目的：利用大鼠胚胎胰腺组织蛋白提取物诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hASCs)向胰岛素分泌细胞分化,为临床胰岛移植寻找新的细胞来源。方法：将新生SD大鼠的胚胎胰腺匀浆后提取胎胰蛋白,重建胰腺微环境,诱导hASCs向胰腺方向分化。诱导组为胎胰蛋白培养组,对照组不添加胎胰蛋白,其余培养条件相同,诱导20 d后,荧光定量PCR技术检测2组胰腺发育相关基因的表达水平,ELISA法检测细胞悬液胰岛素水平,荧光免疫组织化学检测细胞C-肽蛋白表达。结果：在胎胰蛋白诱导过程中,hASCs重要标志基因Oct3/4及Nanog的表达持续降低,说明hASCs逐渐失去全能干细胞的特性;在诱导的第6天开始检测到PDX-1和CK-19的表达上调,诱导细胞出现了胰腺方向的分化,12 d开始检测到胰岛素的阳性表达。所获分化细胞基础相分泌胰岛素量为（287.17± 15.67） mIU•L^-1,高糖刺激下为（401.09±28.94 ）mIU•L^-1,二者比较差异有统计学意义（P<0.01）,且均明显高于对照组的（4.85±1.04） mIU•L-1 (P<0.01);免疫荧光检测,诱导组可见C肽阳性细胞,对照组未见C-肽阳性细胞。结论：模拟的微环境可诱导hASCs分化为有功能的胰岛素产生细胞,具有替代胰岛细胞治疗糖尿病的潜在可能性。     

人脐血间充质干细胞体分离、培养及向脂肪细胞分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能。方法:从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;予10-6M地塞米松、100μg/ml1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50μg/ml抗坏血酸的IMDM培养基,对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,油红-O染色染色鉴定。结果:成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后在细胞胞浆里可见颗粒状红色脂滴形成。结论:脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为脂肪细胞。     

人脂肪间充质干细胞与软骨细胞接触式共培养的实验研究

目的探讨接触式细胞共培养条件下,人软骨细胞对脂肪间充质干细胞的诱导分化效应。方法用4,6-联脒-2-苯基吲哚(PKH26)荧光标记脂肪间充质干细胞,与软骨细胞进行接触式细胞共培养,细胞比例为1:1,单独培养的脂肪间充质干细胞为对照组。共培养2周后,应用流式细胞仪分选荧光标记阳性的脂肪间充质干细胞,提取细胞总RNA,采用Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因的相对表达改变。结果成功分离提取脂肪间充质干细胞;Real-timePCR检测结果显示,共培养组脂肪间充质干细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因相对表达较对照组显著增加(P0.05),蛋白多糖上调307倍,Ⅱ型胶原上调584倍。结论与软骨细胞接触式共培养后,人脂肪间充质干细胞能够被诱导分化为软骨细胞。     

脂肪干细胞的分离培养及成心肌诱导

目的 探讨脂肪干细胞的分离培养以及成心肌细胞分化的可能性,为脂肪干细胞治疗缺血性心脏病的应用提供理论依据。方法自SD大鼠提取脂肪组织,用酶消化法分离脂肪干细胞,培养于a-MEM培养基中。显微镜下观察细胞生长情况及形态特征,流式细胞仪检测脂肪干细胞表面分子的表达情况。用5-氮胞苷对脂肪干细胞进行诱导,显微镜下观察细胞生长情况及形态变化,免疫组织化学方法检测心肌特异性抗体-αActin的表达。结果分离培养的脂肪干细胞形态近似梭形,流式细胞仪检测结果显示CD90及CD105高表达,而CD34及CD45极低表达。经5-氮胞苷诱导后的脂肪干细胞呈类似心肌细胞的形态学特征,免疫组织化学检测结果见心肌特异性标志物-αActin表达阳性。结论脂肪干细胞具有较强的分化为心肌样细胞的能力,可以应用于缺血性心脏病细胞治疗的研究。     

成人脂肪间充质干细胞冻存的实验研究

目的 探寻成人脂肪间充质干细胞冻存和复苏的条件,观察冻存前后脂肪间充质干细胞的形态学特征以及向心肌细胞诱导分化的潜能.方法 自成人脂肪组织分离培养脂肪间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面分子.将脂肪间充质干细胞于液氮中低温冻存,经3个月后复苏,倒置相差显微镜及透射电子显微镜下观察细胞形态.5-氮杂胞苷进行诱导,免疫荧光技术检测心肌特异性肌钙蛋白-Ⅰ.比较冻存前后脂肪间充质干细胞的形态学特征及诱导转化率.结果 脂肪间充质干细胞较幼稚,冻存前后光镜下的形态及电镜下的超微结构无明显差别,脂肪间充质干细胞呈CD29阳性表达,HLA-DR阴性表达.冻存前后脂肪间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导后第28天均可表达心肌特异性肌钙蛋白-Ⅰ,诱导转化率无差异.结论 脂肪间充质干细胞可耐受低温冻存,复苏后细胞的形态学特征以及诱导分化潜能无明显变化.     

脂肪干细胞原代培养及诱导成肌细胞的实验研究

目的 探讨大鼠脂肪干细胞(ADSC)的培养及诱导分化为成肌细胞的方法 .方法 取SD大鼠脂肪组织,酶消化法分离、培养ADSC,免疫荧光和流式细胞仪检测相关表面抗原CD90、CD105和CD34的表达.取培养至第2代处于对数生长期细胞,分别用含5-氮杂胞苷(5-aza)的诱导培养液(诱导组)和基础培养液(对照组)进行培养.诱导时间为7、14、21、28和35 d,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态变化,免疫荧光和流式细胞仪检测成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达.结果 成功从大鼠脂肪组织分离、培养出ADSC,相关表面抗原表达检测证实其干细胞特性.诱导组细胞诱导28 d后呈现成肌细胞特有的"漩涡"样生长形态,单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示,desmin和myosin的表达率在诱导28 d时达最高,分别为52.57%和50.04%,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达.结论 成功从大鼠脂肪组织分离、培养ADSC,含5-aza的诱导培养液可将其诱导分化为成肌细胞,诱导 28 d成肌细胞特异性抗原表达率最高.     

脂肪干细胞原代培养及诱导成肌细胞的实验研究

目的 探讨大鼠脂肪干细胞(ADSC)的培养及诱导分化为成肌细胞的方法 .方法 取SD大鼠脂肪组织,酶消化法分离、培养ADSC,免疫荧光和流式细胞仪检测相关表面抗原CD90、CD105和CD34的表达.取培养至第2代处于对数生长期细胞,分别用含5-氮杂胞苷(5-aza)的诱导培养液(诱导组)和基础培养液(对照组)进行培养.诱导时间为7、14、21、28和35 d,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态变化,免疫荧光和流式细胞仪检测成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达.结果 成功从大鼠脂肪组织分离、培养出ADSC,相关表面抗原表达检测证实其干细胞特性.诱导组细胞诱导28 d后呈现成肌细胞特有的"漩涡"样生长形态,单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示,desmin和myosin的表达率在诱导28 d时达最高,分别为52.57%和50.04%,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达.结论 成功从大鼠脂肪组织分离、培养ADSC,含5-aza的诱导培养液可将其诱导分化为成肌细胞,诱导 28 d成肌细胞特异性抗原表达率最高.     

人脐带间充质干细胞体外培养的生物学特性研究

目的建立人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养的方法,探讨该方法培养的脐带间充质干细胞特性及分化潜能。方法用新取的脐带制成细胞悬液,放入含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养,动态观察原代培养细胞的生长过程。取生长状态良好的第三代细胞(P3),MTT检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测表面标志物CD29、CD44、CD31、CD45、CD34,鉴定hUC-MSCs;诱导hUC-MSCs分化成为脂肪细胞,鉴定所分离的hUC-MSCs具有多向分化能力。结果来源于人脐带培养的MSCs呈现梭形生长,经流式细胞仪检测示CD29(98.3%)、CD44(99.2%)阳性,CD34(0.3%)、CD31(0.8%)、CD45(0.4%)阴性,经过诱导分化,证实hUC-MSCs有成脂分化潜能。结论采自脐带标本分离培养可获得稳定、均质性良好的hMSCs,并具有多向分化能力。     

低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响

目的 研究低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响。方法 采用组织块法分离培养兔脂肪间充质干细胞。用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态,流式细胞仪检测兔脂肪间充质干细胞的免疫表型。取第3代兔脂肪间充质干细胞置于-196℃液氮保存半年,37℃复苏并传至第7代。实验分为两组,实验组为冻存复苏后传至第7代的兔脂肪间充质干细胞,对照组为未冻存的第7代兔脂肪间充质干细胞,用MTT绘制其生长曲线;添加成脂、成骨诱导液进行诱导,油红O、茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测分别进行鉴定。结果 体外培养的兔脂肪间充质干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞仪检测显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD44、CD90,阴性表达造血细胞相关的表面标志CD45。两组细胞生长曲线呈典型的“S”形,无统计学差异（P>0.05）;成脂诱导14 d后,油红O染色呈阳性;成骨诱导2周时茜素红染色阳性,ALP表达活性随成骨诱导时间延长不断增加且无统计学差异（P>0.05）。结论 冻存后的兔脂肪间充质干细胞体外生长及多向分化潜能未发生显著变化。     

转前强啡肽基因修饰人骨髓间充质干细胞株的建立

目的 建立前强啡肽(PDP)基因修饰的人骨髓间充质干细胞株并验证其可在体外增强细胞强啡肽的分泌.方法 本实验运用载体Ad5F35-PDP转染人骨髓间充质干细胞hBMSCs,获得分泌强啡肽的干细胞株(hBMSCs-PDP),以转染空载体的细胞(hBMSCs-空载体)和未转染的细胞hBMSCs作为对照,此3组细胞分别采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD44、CD34、CD45的表达,免疫荧光法检测强啡肽的表达,RT-PCR法检测强啡肽mRNA的表达、Western Blot法测定强啡肽蛋白的分泌.结果 体外实验以流式细胞仪检测此3组细胞的表面标志物CD29、CD44表达均阳性,CD34、CD45表达均阴性且这3组细胞的表达差异比较无统计学意义(P＞0.05).与hBMSCs和hBMSCs-空载体比较,hBMSCs-PDP细胞株强啡肽mRNA的表达和强啡肽蛋白的表达均上调(P＜0.05).结论 本实验成功构建了前强啡肽基因修饰的人骨髓间充质干细胞,并证明转染后的细胞株hBMSCs-PDP可稳定分泌强啡肽并保留干细胞原有的特征表型.     

荧光磁性纳米粒子体外标记骨髓间充质干细胞研究

目的:探索高效体外示踪骨髓间充质干细胞体系的方法。方法:采用贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞CD29、CD90和CD45表达情况,用诱导剂诱导干细胞检测骨髓间充质干细胞的分化能力,采用普鲁士蓝染色,用激光共聚焦显微镜、磁共振成像仪观察荧光磁性纳米粒子标记的干细胞体外成像效果。结果:流式细胞仪检测CD29、CD90和CD45阳性表达率分别为84.69%、90.28%和0.72%;碱性磷酸酶染色和油红O染色结果均表明骨髓间充质干细胞成功分化为成骨细胞和脂肪细胞;普鲁士蓝染色、激光共聚焦显微镜成像和磁共振成像表明荧光磁性纳米粒子标记的骨髓间充质干细胞具有很好的成像效果。结论:荧光磁性纳米粒子作为示踪剂可以在体外标记骨髓间充质干细胞,为干细胞研究提供新思路。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养方法优化

目的：建立一个分离、培养、纯化大鼠的骨髓间充质干细胞的方法。方法使用贴壁法分离大鼠的骨髓间充质干细胞,通过培养初期的频繁换液和传代过程中减少胰蛋白酶的暴露时间,达到骨髓间充质干细胞的纯化。流式细胞仪检测细胞表面标志物,MTT法检测细胞生长状况,暴露于不同的诱导培养基使细胞成骨、成脂,并向肝胆系分化。结果分离所得的细胞阳性表达CD29、CD44、CD90,而对于造血细胞标志物CD45呈阴性。在成骨、成脂培养基的诱导下,细胞ALP、茜素红、油红O染色均呈阳性,并发现传至10代的细胞仍保持分化功能。将骨髓间充质干细胞贯续暴露于不同的细胞因子和激素,得到了表达肝细胞、胆管上皮细胞特异标志的子代细胞。结论通过改良后的方法可以高效、简洁地分离出形态均一的大鼠骨髓间充质干细胞,并能够向多胚层的细胞分化。