骨髓间充质干细胞体外可定向诱导为内皮细胞

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,免疫荧光及免疫组化检测内皮细胞特异性标志物鉴定。结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征可表达CD31及Ⅷ因子。结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。     

间充质干细胞定向诱导为内皮细胞的体外研究

目的:为寻找心血管组织工程新的种子细胞来源,探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,并体外扩增,激光共聚焦显微镜检测表面抗原表达,以含血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)的诱导分化培养液定向诱导传代使其向血管内皮细胞方向分化,观察细胞形态的变化,检测内皮细胞特异性标志物的表达.结果:MSCs在体外传代扩增后激光共聚焦显微镜检测结果显示CD44、CD90表达阳性,CD31、CD45为阴性,分化后细胞具有内皮细胞的形态学特征,并表达内皮细胞特异性标志物CD31.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

大鼠大脑皮层细胞条件培养液促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究

目的建立大脑皮层细胞条件培养液促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的方法。方法原代培养并鉴定骨髓间充质干细胞;用条件培养基、无血清培养基、DMEM分别诱导骨髓间充质干细胞6h和24h;用免疫荧光染色的方法鉴定由骨髓间充质干细胞分化而来的神经样细胞。结果骨髓间充质干细胞表达CD106、CD90、CD29和CD44标记物,不表达CD71、CD45和CD34,回收得到的条件培养基可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,这些神经样细胞的免疫荧光染色呈β微管蛋白Ⅲ、胶质原纤维酸性蛋白、巢蛋白阳性,且阳性比例明显高于实验对照组,差异有高度统计学意义（P〈0.001）。结论大脑皮层细胞条件培养液能促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化。     

大鼠脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞向内皮分化的能力比较

目的研究脂肪干细胞（ASCs）向内皮分化的能力,并与骨髓间充质干细胞（BMSCs）对比。方法从SD大鼠中分离培 养ASCs、BMSCs,选择生长良好的一定代数的细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面标志物;用CCK-8 法绘制细胞生长曲线;进行 标准内皮诱导3 周,用qPCR 检测内皮细胞特异性标志物CD31、KDR、vWF mRNA的表达;免疫荧光染色观察表面抗原 CD31 的表达;用Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）检测诱导组细胞的摄取功能;在Matrigel 上验证诱导组细胞 的成管能力。结果成功分离培养大鼠ASCs和BMSCs,形态上,ASCs与BMSCs类似,均呈长梭形、纺锤状,类成纤维细胞样 形态;流式检测结果显示BMSCs 与ASCs 均高表达间充质干细胞表面标志物CD29（100%与96.9%）、CD90（96.5%与 99.2%）,低表达造血系细胞表面标志物CD45（3.9%与0.8%）,证实所提取的是间充质干细胞;CCK-8 增殖实验结果表明, ASCs的增殖速度比BMSCs的增殖速度快（P<0.05）。标准内皮诱导后,qPCR显示诱导组BMSCs和ASCs表达CD31、KDR、 vWF mRNA水平均高于未诱导组（P<0.05）;免疫荧光染色显示CD31 抗原表达在诱导组的细胞膜表面;荧光显微镜下诱导 组细胞摄取Dil-Ac-LDL（未诱导组不摄取）;诱导组细胞在Matrigel 上均具备成管能力,证实诱导后的细胞为内皮细胞。结 论表明BMSCs和ASCs 均可诱导向内皮细胞分化,ASCs 广泛分化为内皮细胞的时间更短且增殖能力更强,提示ASCs 比 BMSCs更具有应用前景。     

VEGF-C联合HGF促进间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化的研究

目的：使用血管内皮细胞生长因子C（vascular endothelial growth factor C,VEGF-C）与肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）向淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells,LECs）方向分化,寻求最适HGF浓度,探索HGF的促分化机制。方法：原代培养获得BMSCs,流式细胞仪检测相关表面抗原以及向成骨诱导分化鉴定干细胞特性,取原代培养第３代细胞进行诱导实验。设置50 ng/ml VEGF-C分别联合10、20、40、60、80、100 ng/ml HGF配置诱导培养基的6个联合诱导组以及同时设置50 ng/ml VEGF-C诱导组、50 ng/ml HGF诱导组和空白对照组,诱导10 d后利用real-time PCR检测各组LECs标志性分子淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1（lym－phatic endothelial hyaluronan receptor 1,LYVE-1）,同源异形盒蛋白1（prospero homeobox protein 1,Prox1）的表达,得出HGF最适浓度。Western blot、real-time PCR检测HGF诱导组、空白对照组、VEGF-C诱导组的LECs标志性分子LYVE-1、Prox1的表达,以及检测空白对照组、VEGF-C诱导组、HGF联合VEGF-C诱导组的integrinα9的表达。结果：成功分离获得原代培养大鼠BMSCs,80 ng/ml HGF联合50 ng/mlVEGF-C诱导组的LYVE-1、Prox1的mRNA表达量最高（PProx1=0.000,PLYVE-1=0.000）,同时HGF诱导组未检测到相关LECs标志性分子的表达,HGF联合VEGF-C诱导组的integrinα9的表达较VEGF-C诱导组明显提高（PWestern blot=0.001,Preal-time PCR=0.000）。结论：当HGF浓度为80 ng/ml时,此时HGF联合VEGF-C可更好地促进大鼠BMSCs向LECs分化。同时,在该浓度条件下HGF不具有单独诱导大鼠BMSCs分化为LECs的能力,但能在诱导分化过程中明显提高integrinα9的表达,证明在促分化过程中HGF可能是通过间接上调integrinα9表达发挥作用。     

骨髓间充质干细胞表面标记物研究进展

骨髓间充质干细胞之表面标记并不是唯一的,而是兼具间充质、内皮细胞、肌肉细胞的特征。骨髓间充质干细胞可表达多种表面标记物,如黏附分子、生长因子、细胞因子、受体与整合素,但是迄今为止未发现独特的骨髓间充质干细胞表面标记物。因骨髓间充质干细胞具有自我更新与多向分化之潜能,因而相关表达的阳性CD分子及相应基因表达可间接作为骨髓间充质干细胞的检测指标。目前与骨髓间充质干细胞相对应的表面标记物被广泛应用,可用于骨髓间充质干细胞标记的有相应的表面标记物、反映骨髓间充质干细胞的基因以及骨髓间充质干细胞表面阳性CD分子的表达。     

人骨髓基质干细胞体外培养和生物学特性鉴定

目的 体外分离、纯化培养人骨髓基质干细胞(hBMSCs),对其表面标志物、多向分化特性进行鉴定,为骨组织工程提供理想的种子细胞来源.方法 抽取健康成人骨髓,采用全骨髓培养法,多次消化以纯化hBMSCs;应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测;采用成骨、成软骨和成脂培养基进行三向诱导分化.结果 培养的第3代细胞表面抗原检测显示:表达CD106、CD166和CD29,不表达造血和内皮标志CD34、CD45和CD145在体外分别诱导出其向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化.结论 hMSCs体外经分离传代培养后细胞成分较为单一,具有多向分化潜能,符合间充质干细胞的基本功能特征.     

人牙髓干细胞和根尖乳头干细胞体外分化能力的对比研究

目的 对比研究人牙髓干细胞(DPSCs)和根尖乳头干细胞(SCAP)的体外生长特性、增殖及矿化能力.方法 采用酶消化法体外培养人DPSCs和SCAP,诱导分化培养基诱导细胞成骨/成牙本质向分化,流式细胞仪检测特异性标记物,茜素红染色检测矿化程度,逆转录PCR(RT-PCR)检测分化标记物表达.结果 人DPSCs和SCAP为成纤维细胞样贴壁生长,SCAP增殖率较高;两种细胞表达特异性间充质干细胞(MSCs)标记物:CD34、CD45(-),CD90、CD105、CD146(+),基质细胞抗原1(STRO-1)、八聚体转录因子4(OCT-4)(+),SCAP特异性标记物CD24(+).成骨诱导3周可形成明显钙化结构,SCAP钙化能力较强.成骨诱导2周2种细胞均可表达分化标记物:骨涎蛋白、骨钙素、牙本质涎磷蛋白,且随诱导时间表达逐渐增加.结论 人DPSCs和SCAP均具有间充质干细胞典型特征,可分化为成牙本质样细胞,是牙源性组织工程的可靠于细胞来源.     

3种口腔颌面部来源的间充质干细胞成血管内皮分化潜能的比较研究

目的:研究来自口腔颌面部的脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED)、牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSC)和颌骨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)的增殖能力及成血管内皮细胞分化潜能,为血管组织工程再生种子细胞的选择提供依据。方法:取临床乳牙和恒牙牙髓组织及颌骨组织并采用酶消化法分离培养相应的间充质干细胞,流式细胞技术检测间充质干细胞相关表面抗原的表达。采用CCK-8 (cell counting kit-8)法检测细胞的增殖能力。通过Matrigel三维培养技术诱导间充质干细胞成血管内皮细胞分化,并通过管腔计数及real-time PCR技术比较3种间充质干细胞的成血管内皮细胞分化能力。采用鸡胚绒毛尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane, CAM)技术观察3种不同间充质干细胞新生血管能力。结果:3种干细胞均阳性表达CD73、CD90、CD105、CD146,阴性表达 CD34、CD45,符合间充质干细胞表面标记物的表达规律。SHED和DPSC的CD146表达率多于BMSC,CCK-8法检测显示SHED的增殖能力最强。诱导后的3种细胞均可在Matrigel基质胶上形成管腔样结构,诱导后SHED和BMSC形成的血管总长度大于DPSC,SHED形成的管腔数多于BMSC和DPSC。real-time PCR 结果显示几种成血管相关的细胞因子在不同细胞间表达存在差别。诱导后SHED的CD31、VEGFR2、vWF表达显著高于另外两种细胞。BMSC的VEGFR1表达量高于其他组,SHED高于DPSC。VEGF的表达在4组之间差异无统计学意义。3种细胞在CAM上计数新生血管数目显示较空白对照组差异无统计学意义,SHED组血管总长度较空白对照和BMSC大。结论:SHED、DPSC及 BMSC均能向成血管内皮细胞方向诱导分化且在Matrigel培养基上形成血管和管腔,SHED具有更强的分化和形成管腔的能力,同时SHED较BMSC及DPSC具有更强的增殖能力。     

骨髓间充质干细胞诱导为血管内皮样细胞的实验研究

目的 探讨犬骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向血管内皮样细胞分化的机制.方法 骨髓穿刺获取犬骨髓,提取单个核细胞,取第2～4代细胞用含VEGF的培养液诱导,对细胞进行形态学观察和相关抗原的免疫荧光鉴定.结果 BMMSCs在含VEGF的培养液中诱导,2周后外观呈现鹅卵石样,免疫表型显示vWF阳性表达,透射电镜可见细胞具有血管内皮细胞的特点.结论 骨髓间充质干细胞可在体外分化为具有血管内皮细胞特性的细胞.     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

内皮祖细胞外泌体抑制紫杉醇诱导的血管内皮细胞焦亡

目的：探索内皮祖细胞外泌体（EPCs-Exo）对紫杉醇诱导的内皮细胞焦亡的影响及其可能机制。方法：培养原代骨髓间充质干细胞（BMSCs）和内皮祖细胞（EPCs）并鉴定。提取BMSCs和EPCs培养液中的外泌体,使用透射电镜观察外泌体形态并检测CD63和CD9的表达鉴定外泌体。分别用BMSCs-Exo和EPCs-Exo干预经紫杉醇诱导的内皮细胞焦亡模型,光镜下观察细胞形态;Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD9和细胞焦亡相关蛋白NLRP-3、IL-18、GSDMD-N的表达情况;电镜下观察细胞超微结构的变化。基因芯片检测两组外泌体中差异的非编码RNA,RT-qPCR检测lncRNA FGD5-AS1表达情况。结果：大鼠骨髓细胞中分离培养分化出BMSCs和EPCs,免疫荧光法证实BMSCs中CD90 和CD44阳性,EPCs中CD34 和VEGFR2阳性。相比于对照组,紫杉醇组细胞膜被破坏,细胞内线粒体间距离增加,细胞内纤维排列紊乱,细胞中NLRP-3、IL-18、GSDMD-N等细胞焦亡蛋白表达增加（P ＜0.05）;相比于紫杉醇组,紫杉醇+EPCs-Exo组内皮细胞中细胞膜较完整,细胞系损伤较轻,NLRP-3、IL-18、GSDMD-N表达减少（P ＜0.05）;紫杉醇组与紫杉醇+BMSCs-Exo组内皮细胞形态和焦亡蛋白的表达差异无统计学意义。芯片及RT-PCR结果显示相比于BMSCs-Exo,lncRNA FGD5-AS1在EPCs-Exo中表达增加（P ＜0.05）。结论：EPCs外泌体抑制紫杉醇诱导的血管内皮细胞焦亡。     

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。     

EphrinB2基因工程的骨髓间质干细胞对分化成血管内皮细胞的影响

目的 观察研究ephrinB2基因转染对体外诱导环境大鼠骨髓问质干细胞(BMSCs)分化成血管内皮细胞的促进作用.方法 采用密度梯度离心-贴壁培养法从Wistar大鼠骨髓中得到BMSCs.采用lenti-virus载体装载人ephrinB2基因转染大鼠BMSCs.采用流式细胞计数测定CD105、CD73、CD44、八因子(VWF)和血管内皮生长因子受体(KDR)等标志物在ephrinB2-BMSCs中的表达,并探讨其向成骨细胞及脂肪细胞体外分化的多向分化潜能.以2％FBS和50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF)的培养条件,体外诱导ephrinB2-BMSCs向血管内皮细胞分化,并测定相应标志物的表达.结果 未经诱导分化的ephrinB2-BMSCs表达CD105、CD73和CD44,不表达血管内皮细胞特异性标志物VWF和KDR.转染后的ephrinB2-BMSCs依然具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的多向分化潜能.经诱导,ephrinB2-BMSCs表达VWF与KDR,并且其生成血管内皮细胞的比率及在Matrix基质上形成毛细血管样结构的比率均显著高于未转染ephrinB2的BMSCs.结论 ephrinB2基因工程的BMSCs具有极高的向血管内皮细胞分化的潜能.这种基因工程细胞为建立冠心病患者的临床治疗新方法提供了有意义的资源.     

骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞Angiogenin1，Angiogenin2基因的表达

目的：研究骨髓基质干细胞来源的血管内皮细胞表达成熟血管内皮细胞特异性基因,探讨为组织工程血管化提供种子细胞的可行性．方法：从SD大鼠后肢获取骨髓基质干细胞,进行体外扩增培养,取生长良好的第3代细胞体外诱导培养14d．细胞分诱导组（含内皮诱导因子VEGF和bFGF的完全血管内皮细胞条件培养基）和对照组（含M199普通培养基）．MTT法检测两组细胞增殖活性．免疫细胞化学法检测CD31,CD34蛋白的表达;RT—PCR检测细胞血管生成素1（Ang1）、血管生成素2（angiogenin2,Ang2）mRNA的表达．结果：MTT法检测发现,诱导组与对照组在1,2,3,4,5d5个时间点内,其细胞增殖活性无显著性差异（P1d=0．855,P2d=0．053,P3d=0．249,P4d=0．059,P5d=0．174）．免疫细胞化学检测结果CD34,CD31呈阳性表达．RT—PCR结果显示,诱导的血管内皮细胞表达成熟内皮细胞特异性基因Ang1,Ang2．结论：骨髓基质干细胞在一定诱导条件下可以表达血管内皮细胞特异性标志,可作为组织工程血管化理想的种子细胞．     

兔全骨髓培养诱导分化获取内皮祖细胞

目的探讨采用将兔全骨髓直接体外培养诱导分化的方法获取内皮祖细胞(EPCs),同时观察EPCs的扩增能力。方法新西兰兔10只,对每只兔穿刺并抽取骨髓3 ml,用EGM-2培养基对全骨髓进行培养,观察细胞生长及形态变化,绘制细胞生长曲线并评估其扩增能力。对培养12 d后的贴壁细胞行CD133、CD34、VEGFR-2三抗原免疫组化鉴定及吞噬乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)和结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的内皮细胞功能鉴定;同时对其行CD133免疫磁珠分选及流式细胞术检测,比较分选前后的CD34+/VEGFR-2+和CD133+/CD34+/VEGFR-2+细胞比例的差异。结果全骨髓直接培养48 h后可见细胞呈丛状或集落样生长,细胞呈梭形、三角形、多边形,细胞生长曲线呈"S"型。经过12 d的培养,每3 ml骨髓可以获得(1.51±0.29)×106个贴壁生长的EPCs,细胞呈铺路石样外观;检测发现CD133、CD34、VEGFR-2三抗原阳性表达,并具有吞噬ac-LDL和结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的内皮细胞功能。经CD133免疫磁珠分选后CD34+/VEGFR-2+和CD133+/CD34+/VEGFR-2+的细胞比例数分别为分选前的3.38倍和6.14倍。结论通过全骨髓直接培养诱导分化获取兔EPCs的方法简单、可行。     

成骨细胞及血管内皮细胞复合同种异体颗粒骨治疗大鼠股骨头坏死

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)来源的大鼠同种异体成骨细胞(osteoblast,OB)及血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VEC)与同种异体颗粒骨复合后治疗大鼠创伤性股骨头坏死(osteonecrosis of th...     

BMSCs/EPCs联合移植治疗兔股骨头坏死的实验研究

目的 检测骨髓来源内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）与骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）移植到股骨头缺血坏死部位促进坏死区局部成骨和成血管能力.方法 使用密度梯度离心法分离培养兔BMSCs、EPCs并鉴定.共培养细胞进行碱性磷酸酶活性检测以确定EPCs与BMSCs最佳比例.培养的细胞分成3组植入兔股骨头坏死模型：A组（单独移植BMSCs）、B组（单独移植EPCs）、C组（最佳比例联合移植BMSCs与EPCs）,于术后4周对兔股骨头坏死模型进行成骨及成血管指标检测.结果 EPCs与BMSCs的最佳共培养比例为1∶1.与A组及B组相比,C组有着更高的BMP-2蛋白表达和更多的新生血管形成（P＜0.05）.组织学检测显示：A组可见类骨质结构;B组可见血管结构,但类骨质生成较少;C组可见类骨质结构,并且可见密集的血管结构.结论 以1∶1比例联合移植EPCs和BMSCs到股骨头坏死部位具有很强的成骨以及成血管能力.     

骨髓基质细胞源内皮细胞移植对血管性痴呆大鼠行为及VEGF蛋白表达的影响

目的 探讨骨髓基质细胞（BMSCs）向血管内皮细胞诱导分化后移植对血管性痴呆（VD）大鼠行为及血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响.方法 采用2-AO法制作VD大鼠模型;经Y型电迷宫筛选健康SD大鼠随机分为假手术组（n=8）、PBS移植组（n=8）、BMSCs移植组（n=8）、BMSCs源内皮细胞移植组（VECs移植组,n=8）;移植30天后Y型电迷宫检测大鼠学习记忆能力;处死大鼠,大鼠脑切片检测VEGF蛋白表达、海马CA1区锥体细胞数.结果 VECs移植组、BMSCs移植组、PBS移植组大鼠学习记忆能力均较假手术组下降（P〈0.05）.移植后30天各组神经功能均有不同程度的恢复,VECs移植组大鼠的学习记忆能力显著优于BMSCs移植组（P〈0.05）;VECs移植组VEGF阳性细胞多于BMSCs移植组（P〈0.05）;VECs移植组海马CA1区锥体细胞数高于BMSCs移植组（P〈0.05）.结论 BMSCs源内皮细胞移植町改善VD大鼠学习记忆能力,增加VEGF蛋白表达和保护海马区神经元,显著优于BMSCs移植.