单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白基因 真核共表达质粒的构建

 【目的】 构建含有人巨细胞病毒(CMV)调控表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP。【方法】 设计HSV-tk cDNA的特异引物,PCR扩增获得HSV-tk基因序列, 将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒pMD18T-TK,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ分别酶切pMD18T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒,将HSV-tk基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含EGFP和HSV-tk基因的重组质粒,Lipofectin介导转染小鼠黑色素瘤B16细胞并检测其表达情况。【结果】 酶切见特异酶切图谱, 该质粒在瞬时表达时获得EGFP的良好表达。【结论】 含HSV-tk和EGFP基因真核表达质粒pCMV-TK-IRES-EGFP构建成功,为利用绿色荧光蛋白标记在后续实验中进行自杀性基因治疗的深入研究奠定了基础。     

结核杆菌热休克蛋白70与绿色荧光蛋白基因真核共表达质粒的构建

目的 利用pIRES-EGFP载体构建含有人巨细胞病毒(cytomegaloviru,CMV)启动子调控表达的结核杆菌热休克蛋白70(mtHSP70)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子真核表达载体pCMV-hsp70-IRES-EGFP.方法 根据mtHSP70基因全长cDNA的特异引物PCR扩增获得mtHSP70基因序列.将PCR产物进行T载体克隆获得重组质粒PMD-18T-mtHSP70,测序分析选定序列正确的克隆提取质粒,用限制性内切酶Xho I和EcoR I酶切pMD 18 T-TK和pCMV-IRES-EGFP质粒.将mtHSP70基因定向亚克隆至pCMV-IRES-EGFP载体,酶切鉴定,构建获得含mtHSP70和EGFP基因的重组质粒.Lipofectamine介导下转染B16细胞,并分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达和以Western blot检测mtHSP70蛋白表达情况. 结果 酶切见特异酶切图谱,该载体在瞬时表达时获得mtHSP70/EGFP的良好表达.结论 含mtHSP70和EGFP基因双顺反子真核表达载体pCMV-mtHSP70-IRES-EGFP构建成功,为研究基于以GFP为报告基因的mtHSP70的肿瘤DNA疫苗对肿瘤的治疗作用及机制奠定了实验基础.     

人IL-26的基因克隆及其真核表达载体的构建

基因，构建其真核表达载体并探讨在真核细胞中的表达。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA，逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）扩增hIL 26基因；目的片段与pMD18 T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α,菌落PCR、酶切分析和DNA序列分析鉴定重组克隆。用SalⅠ和EcoRⅠ将目的片段切下，插入pIRES2 EGFP的相应位点，构建表达载体pIRES2 EGFP/hIL 26并进行酶切鉴定。将重组质粒用非脂质体试剂Fugene 6转染至COS7细胞中。结果：重组克隆载体pMD18 T/hIL 26内插入片段序列与GenBank上报道的hIL 26基因序列完全一致；pIRES2 EGFP/hIL 26经酶切鉴定与预期结果一致；荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现，Western blotting 鉴定证明hIL 26基因得到了有效表达。结论：成功构建了hIL 26基因的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达。     

pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建

【目的】构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础。【方法】设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoh．DH5（大肠杆菌）,大量扩增重组质粒。试剂盒纯化重组质粒。用Lipofectamine^TM 2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达。【结果】pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Westernblotting检测融合蛋白分子量为47kd,符合预期值。【结论】成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-svnuclein。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白与肝细胞生长因子共表达载体的构建及表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白与人肝细胞生长因子基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达.方法:在HGF两端设计并合成分别带有Sac I和BamH I两酶切位点的一对引物,对pcDNA3.0-HGF载体进行PCR扩增,将扩增出的目的基因与pMD18-T载体相连,并转化大肠肝菌,进行菌落PCR、酶切分析和DNA测序鉴定重组克隆.用Sac I和BamH I将目的片段用双酶切切下后,纯化提取凝胶中的目的DNA片断,然后插入pIRES-EGFP相应的酶切位点,构建pIRES-EGFP/HGF真核表达载体并再进行酶切鉴定.将重组质粒用脂质体法转染至人脐带血管内皮细胞(HUVEC)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达及Western blotting检测HGF的表达情况.结果:重组克隆载体内的目的片段序列与GENE BANK上报道的HGF基因序列完全一致.pIRES-EGFP/HGF酶切鉴定结果与预期结果一致.荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现.Western blotting结果表明HGF基因得到了有效表达.结论:本实验成功构建EGFP和HGF真核共表达载体并可在真核细胞中有效表达.     

hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ的构建及其在PC-3M细胞中的表达

目的：构建人雌激素受体β（hERβ）全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法：采用RT-PCR法从卵巢囊肿患者切除的部分正常卵巢组织中钓取hERβ全长基因（1 593 bp）,与pMD18-T载体连接做全自动序列测定。将测序正确的克隆质粒pMD18-T-hERβ和表达载体pEGFP-C1分别用Hind Ⅲ和BamHⅠ进行双酶切,应用基因重组技术构建hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染PC-3M细胞。结果：重组质粒经限制性酶切鉴定得到与hERβ全长基因长度一致（1 612 bp）的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的hERβ基因（NM_001437）序列完全一致,表明成功地完成了hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达;PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论：构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,hERβ基因在PC-3M细胞内成功表达。     

增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因共表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达.方法 用PCR技术对cDNA-Rb质粒中的目的基因片段进行扩增,使用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切,切胶回收DNA片段.将其连接入pEGFP-C1,构建pEGFP-C1/Rb94真核表达载体并再进行酶切鉴定.将重组质粒用脂质体转染法转染至人视网膜母细胞瘤细胞(HXO-Rb44)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达,Western blot检测Rb蛋白的表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 重组克隆载体内的目的片段序列与Rb94基因序列完全一致.pEGFP-C1/Rb94酶切鉴定结果与预期结果一致.荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现.Western blot检测结果表明Rb94基因得到了有效表达.流式细胞仪检测结果显示,含Rb94基因的细胞凋亡率为(21.17±0.45)%,明显高于其他组(P<0.05).结论 成功构建EGFP和Rb94真核共表达载体,并可在真核细胞中有效表达,Rb94对视网膜母细胞瘤细胞有明显抑制生长作用.     

人HMGB1真核表达载体的构建及其在单核细胞的表达

目的构建人高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达载体,并探讨其免疫调节作用。方法从HMGB1克隆载体酶切分离HMGB1基因片段,插入增强型绿色荧光蛋白载体pCITE EGFP,菌落PCR和酶谱分析鉴定重组载体。重组表达质粒转染人单核细胞系（U937）,梯度G418筛选,荧光和Western blot检测HMGB1的表达。结果菌落PCR和酶谱分析显示目的基因被正确插入真核表达载体,获得重组质粒pCITE EGFP HMGB1,转染U937细胞随培养基中G418浓度的升高而增强,转染细胞中目的蛋白HMGB1表达量明显升高。结论成功构建重组载体pCITE EGFP HMGB1,并获得稳定表达人HMGB1的单核细胞系,为研究HMGB1对单核巨噬细胞的作用及其机制奠定基础。     

人可溶性血管内皮生长因子受体-2基因的克隆与鉴定

目的获取人可溶性血管内皮生长因子受体-2(sKDR)基因,构建sKDR基因真核表达载体,为进一步研究sKDR抗肿瘤血管生成的基因治疗奠定基础。方法提取人胎盘组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增获得sKDR基因cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中,测序证实后,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pMD18-T-sKDR重组载体,胶回收sKDR基因,再将其定向亚克隆到真核表达载体pCMV-Script中,提取质粒做双酶切和测序鉴定。结果构建的重组sKDR基因真核表达载体pCMV-Script-sKDR分别做双酶切和测序鉴定,证实其中含有sKDR基因,测序结果经BLAST分析,与预期设计的编码区cDNA序列一致。结论成功克隆了人sKDR基因的真核表达载体。     

携带IRES的hBDNF绿色荧光蛋白表达载体的构建和鉴定

目的构建表达人脑源性神经生长因子(hBDNF)基因的真核细胞表达载体,并且观察重组质粒在真核细胞中的表达情况。方法采用PCR方法从健康人基因组中扩增出该基因,将hBDNF的PCR产物用XhoⅠ和SalⅠ双酶切后克隆到用XhoⅠ和SalⅠ双酶切的带有EGFP和内部核糖体转入位点(IRES)的真核细胞表达载体pIRES2-EGFP中。对重组质粒进行双酶切和质粒测序鉴定后,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将重组的质粒转染至真核细胞中,用RT-PCR和荧光显微镜检测基因在细胞中表达的情况。结果双酶切和质粒测序结果证明hBDNF已正确地克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,质粒能在细胞中正常表达。结论成功构建了EGFP/hBDNF表达载体,为应用hBDNF治疗中枢神经系统疾病奠定坚实的基础。     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子（HIF-1α）真核表达载体，为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法 采用分子克隆技术，KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3．1／V5-Hin—HIF-1仅获得HIF-1仅cDNA，克隆到质粒pcDNA3．1（＋），得到质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1α，以KpnⅠ，ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1仅获得HIF-1α cDNA，克隆到质粒pEGFP—c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞，用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α 在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功。荧光显微镜和Westom blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP—HIF-1α—c1并在HEK293细胞表达，为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。     

牛pcDNA3-bFGF真核表达重组体的构建与鉴定

【目的】构建并鉴定牛碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)基因真核表达质粒。【方法】设计含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的bFGFcDNA引物 ,采用PCR法从原核pET3c bFGF中扩增bFGFcDNA片段 ,纯化PCR产物 ,EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并连接至 pcDNA3 ,转化感受态大肠杆菌DH5α ,酶切鉴定阳性重组子 ,并进行序列测定。【结果】经PCR能扩增出 4 83bp的片段 ,与预期片段大小相符 ,构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段 ,测序结果与预期序列完全一致。【结论】成功构建了牛bFGF真核表达重组体bFGF pcDNA3 。     

未知基因CGI-100的克隆及其真核表达载体的构建

目的:为探讨研究未知基因CGI-100的功能,克隆人CGI-100基因并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从人白血病K562细胞中克隆CGI-100基因全长编码区,将该cDNA片段亚克隆至载体pMD18-T SimpleT中,经测序鉴定后,用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切将目的cDNA片段定向克隆至相同处理的pIRES2-EGFP真核表达质粒中,然后经酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定.结果:经酶切、PCR及测序鉴定证实,CGI-100基因全长编码区cDNA被准确正向插入至pIRES2-EGFP质粒的酶切位点BamH Ⅰ和Pst Ⅰ之间,未发现碱基突变或移位.结论:成功地构建并鉴定了含CGI-100基因全长编码区的真核表达质粒,为以后研究该基因的功能奠定了基础.     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

【目的】克隆人类DNA聚合酶 (pol β)基因全长cDNA ,构建该基因的真核高效表达载体。【方法】抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT PCR扩增 ,用pGEM T载体经T/A克隆、DNA测序确定后 ,用双酶切将 pol β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体 pEGFP C1,转染大肠杆菌DH5α ,筛选阳性克隆 ,双酶切鉴定重组质粒。【结果】经RT PCR获得 1 0 3kb的产物 ,经DNA测序 ,确定所扩增片段为人类 pol β基因全长cDNA ,进而成功筛选出真核表达载体 pEGFP C1 β。【结论】成功构建人 pol β基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

LMP-1增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白-1(LMP-1)增强型绿色荧光蛋白真核表达载体.方法 用PCR的方法从EB病毒阳性的鼻咽癌组织中调取EB病毒潜伏膜蛋白-1的基因,然后定向克隆到真核表达质粒pEGFP-C3上,以此构建成重组质粒pEGFP-C3-LMP1.结果 经酶切及测序鉴定,确定已获得重组质粒pEGFP-C3-LMP1.结论 在增强型绿色荧光蛋白真核表达质粒中已成功克隆了EB病毒LMP-1基因.     

L型电压门控钙通道α1C亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法 采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达.结果 扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带.结论 成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达.