干细胞移植治疗冠心病的应用进展

干细胞移植治疗急性心肌梗死在基础和临床研究中均倍受争议。目前从骨髓干细胞移植后临床试验的尸检报告已经确定干细胞可以分化成心肌细胞。目前用于移植的干细胞主要分为胚胎干细胞和成体干细胞,胚胎干细胞增殖活跃且具有全能性,但由于其安全性而很难进入临床。成体干细胞主要包括骨骼肌干细胞、骨髓干细胞以及心脏干细胞等,成体干细胞由于没有移植排斥及明显的副作用已经进入临床,其中应用较广的是骨髓干细胞,但对其有效性也充满了争议。移植的时机和方式也是目前人们关注的热点,尚没有统一的认识。干细胞移植后所引起的心肌梗死、心律失常等副作用已经引起了人们的关注。     

虎杖甙对缺血缺氧平滑肌细胞PKC活性的影响

目的通过观察虎杖甙(PD)对缺血缺氧(模拟失血性休克)平滑肌细胞内蛋白激酶C活性的影响,探讨虎杖甙抗休克和调节血管平滑肌细胞收缩性的机制.方法取培养的大鼠主动脉平滑肌细胞,用DE-52纤维素层析方法初步提纯PKC,用组蛋白ⅢS作为底物,用同位素闪烁计数的方法测量其活性.实验分组如下对照组(不加任何刺激),单纯PD组(加PD作用2h,PD终浓度为0.4mmol/L),缺氧组(按Koyama法复制缺血缺氧模型,平滑肌细胞置于无氧无血清无糖环境培养4h后收集细胞,不做其它处理),PD治疗组(缺氧组基础上加PD治疗2h,PD终浓度为0.4mmol/L),治疗对照组(缺氧组基础上加等量D-Hanks作用2h).结果对照组平滑肌细胞胞浆PKC活性为(11.08±3.13)fmol·mg-1·min-1,单纯PD处理可使平滑肌细胞胞浆PKC活性增加,达到(30.02±4.16)fmol·mg-1·min-1,和对照组相比有显著差异(P＜0.05).缺氧损伤后胞浆PKC活性也显著上升为(21.62±3.57)fmol·mg-1·min-1(P＜0.05),而经PD治疗后胞浆PKC活性下降为(11.52±2.33)fmol·mg-1·min-1,和未治疗时相比有显著差异(P＜0.05).而治疗对照组为(21.39±3.54)fmol·mg     

虎杖苷对缺血缺氧下心肌细胞蛋白激酶C的影响

目的探讨虎杖苷对缺血缺氧作用下心肌细胞蛋白激酶C(PKC)活性的影响及其抗休克的机制。方法取大鼠乳鼠心室肌培养心肌细胞,用Koyama方法复制心肌细胞缺血缺氧模型。用γ-闪烁计数仪测定PKC的活性。结果正常状态下心肌细胞胞质PKC经虎杖苷(PD)刺激后活性下降(vs正常组P<0.05),但胞膜的PKC活性上升(vs正常组P<0.05)。缺血缺氧后胞质和胞膜PKC的活性均下降(vs正常组P<0.05),再经PD处理后胞质胞膜的PKC活性均上升(vs缺血缺氧组P<0.05,vs正常组P>0.05)。结论PD对缺血缺氧作用下的心肌有保护作用,可能是通过调节PKC的活性来发挥作用的,这可能是PD抗休克的分子机制之一。     

人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的构建能在哺乳动物细胞得到常氧下高表达的携带HIF-1α突变型HIF-1α-Ala402-Ala 564基因真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564。方法 采用分子克隆技术，在业已完成的pShuttle2-HIF-1α—Ala564的基础上，用连续聚合酶链式反应（PCR）定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA，构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α—Ala402-Ala564。结果 经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564构建成功。结论 成功构建重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564，为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定基础。     

大鼠下肢缺血模型中双位点诱变体HIF-1α的促血管新生作用

目的探讨双位点诱变体低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因(Ad-H564/803)在动物体内的表达及生物学功能。方法构建急性大鼠下肢缺血模型,随机分为4组,分别以Ad-LacZ、Ad-H0、Ad-H564/803和生理盐水(NS)转染术侧下肢骨骼肌,于转染后1,3,5,7d,RT-PCR测定骨骼肌中HIF-1αmRNA的表达量;基因转染后28d,选择下肢动脉造影及动脉铸型观察血管密度。结果RT-PCR结果显示:Ad-H564/803组HIF-1αmRNA相对表达量较Ad-H0组高(P=0.000);以转染后7d表达量最高(P=0.000);第3,5,7dAd-H564/803组的表达量均高于其它各组(P=0.000)。基因转染28d后造影显示:Ad-H564/803组的侧支血管密度大于Ad-H0组及其他各组;动脉铸型显示:Ad-H564/803组的绒毛样微血管最为密集。结论外源性双位点诱变体HIF-1α基因(Ad-H564/803)可增强急性下肢缺血模型大鼠骨骼肌内HIF-1αmRNA的表达,促进缺血骨骼肌中的血管新生,且生物学功能较野生型HIF-1α基因更强。     

虎杖苷对肺血管内皮细胞一氧化氮的影响

目的观察虎杖苷(PD)对肺血管内皮细胞(PECs)正常及缺氧培养条件下合成一氧化氮(NO)的影响从而探讨PD抗休克的可能作用机制。方法将Griess试剂加入培养液中,用紫外分光光度计测量Griess试剂与NO2-反应的OD值,通过绘制的OD-NO2-标准曲线计算NO的值。分别观测了PD在不同时间点及不同浓度下对PECs的NO表达量的影响,并观察了PD对缺氧条件下PECs表达NO的影响。结果随着PD浓度的增加,PECs的NO表达量增高,最高为(30.86±2.83)μmol/L,与对照组相比差异有显著性(P0.01)。随着PD作用时间的延长,PECs合成NO的量也逐渐增加,以24h最高,为(29.69±4.51)μmol/L,与起始点相比差异有显著性(P0.01)。缺氧刺激下,PECs的NO表达量下降,PD可以对抗此作用。结论PD可能通过调节内皮细胞的NO表达量来发挥其抗休克的作用,这可能是其抗休克的分子作用机制之一。     

亲和素桥连构建携抗P选择素单抗靶向超声微泡及体外荧光鉴定

目的 体外荧光方法鉴定生物素-亲和素-生物素(BSB)桥连技术构建携带抗P-选择素单抗靶向超声微泡(MB-BSBp)的町靠性.方法 不同荧光标记物分别标记MB-BSBp的不同部位,观测微泡荧光强度(0、1、2和3级),以普通脂质超声微泡(MB)作对照.结果 加入FITC荧光亲和素孵育,生物紊化脂质微泡(MB-B)呈现明亮的绿色荧光(3级),而MB无荧光显示(0级).以两个浓度梯度(1:4和1:16)的DTAF荧光二抗(抗抗P-选择素单抗抗体)标记MB、MB-B、MB-BS和MB-BSBp,MB-BSBp在两个浓度梯度下均发出明亮的绿色荧光(3级);而MB-B、MB-BS仅在1:4时显示微弱的绿色荧光(1级),MB在两个浓度梯度下均无荧光显示(0级).结论 抗P-选择素单抗通过亲和素桥连有效装配在MB-B表面,体外荧光法是鉴定靶向微泡配体连接可靠性的简便方法.     

突变型HIF-1α基因对人骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

目的 探讨突变型低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）基因对体外诱导环境人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells ,hMSCs）分化成心肌样细胞(cradiomyocyte-like)过程中的影响。方法 重组腺病毒Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402和Ad-HIF-1α564/803以最佳转染复数转染体外5-氮胞苷（5-azacytidine, 5-aza）诱导的hMSCs,诱导培养后第4周,提取细胞浆蛋白,一步法酶联免疫分析检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)含量;Western blot测定HIF-1α及VEGF蛋白表达水平。结果 5- aza诱导hMSCs第4周cTnI值 ：Ad-HIF-1αnature(0.426 ±0.001)、Ad-HIF-1α564(0.424±0.002)、Ad-HIF-1α564/402 (0.428±0.005)、Ad-HIF-1α564/803（0.441±0.003）、空白组（0.411±0.010）、Ad-LacZ（0.410±0.016）,各实验组有显著性差异（P<0.05）;Ad-HIF-1α564/803 组cTnI表达高于Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402三组（P<0.05）。Western blot结果显示Ad-HIF-1αnature、Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402和Ad-HIF-1α564/803 四组HIF-1α及VEGF蛋白表达水平均较Ad-LacZ组高,有显著性差异（P=0.000）, 但Ad-HIF-1α564、Ad-HIF-1α564/402和Ad-HIF-1α564/803 与Ad-HIF-1αnature相比,各组间两种蛋白表达均无显著性差异(P<0.05)。结论 野生型HIF-1α 基因及突变型能促进5-aza诱导的hMSCs向心肌样细胞转化,为HIF-1α及hMSCs 在心肌再生中的联合应用奠定了实验基础。     

益气通络丹对缺血缺氧刺激下心肌细胞蛋白激酶C活性的影响

目的观察益气通络丹对缺血缺氧条件下心肌细胞蛋白酶C的影响以探讨其治疗缺血缺氧性心血管疾病的机制。方法取大鼠乳鼠心脏心室肌培养心肌细胞,用Koyama方法复制心肌细缺血缺氧环境。经益气通络丹大鼠血清处理细胞后,应用液体闪烁计数仪测定PKC(protein kinase C,蛋白激酶C)的活性。结果与正常组比较缺血缺氧状态下心肌细胞胞浆和胞膜的PKC活性均下降(P<0.05),与缺血缺氧组比较经益气通络丹治疗后胞浆和胞膜的PKC活性均有所上升(P<0.05)。结论益气通络丹对缺血缺氧性心血管疾病的治疗作用可能与调节心肌细胞的PKC活性有关。