铜绿假单胞菌普通菌毛与耐药性R质粒关系的探讨

目的检测铜绿假单胞菌PA38耐药株的耐药性R质粒与普通菌毛及粘附性的关系。方法应用琼脂糖凝胶电泳试验、电镜照片制备、粘附试验及质粒消除试验。结果铜绿假单胞PA38菌株含有一条相对分子质量是3.3×106的R质粒;电镜下观察该菌株具有周毛型菌毛:粘附试验可见该菌大量粘附到脱落的尿道上皮细胞上;该R质粒消除后该菌株的耐药性与普通菌毛一起消失,粘附性明显减弱。结论铜绿假单胞菌PA38菌株编码普通菌毛、决定粘附性的基因主要是在相对分子质量为3.3×106的一个R质粒上。     

某医院2011—2021年铜绿假单胞菌的临床分布及其耐药性

目的 了解铜绿假单胞菌(PAE)的临床分布及其对抗菌药物的耐药性变迁,为临床合理使用抗菌药物提供参考。方法 回顾性分析住院患者非重复分离铜绿假单胞菌。应用质谱仪、Vitek2 Compact全自动微生物分析仪、Walkaway96全自动微生物鉴定及药敏仪对菌株进行鉴定和药敏试验,K-B法药敏试验作为补充。应用WHONET5.6软件和R×C表χ²检验进行数据分析。结果 共收集非重复铜绿假单胞菌3 657株,耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(CRPA)共检出527株,耐碳青霉烯铜绿假单胞菌/铜绿假单胞菌占比呈逐年下降趋势。2011—2021年铜绿假单胞菌对阿米卡星、氨曲南和环丙沙星等14种抗菌药物的耐药率差异具有统计学意义,ICU分离铜绿假单胞菌对检测抗菌药物耐药率均高于住院非ICU科室,除多粘菌素和哌拉西林外,差异均有统计学意义。结论 本地区分离铜绿假单胞菌对常用抗菌药物耐药性存在趋势性改变,CRPA检出率呈逐年下降趋势,临床应根据药敏试验结果合理选择抗菌药物。     

五倍子提取液对铜绿假单胞菌R质粒体外消除作用的实验研究

铜绿假单胞菌是院内感染的主要致病菌,带有耐药质粒的铜绿假单胞菌的大量存在,是造成这种情况的主要原因.用人工方法使R质粒从宿主菌中消除,使其恢复对抗生素的敏感性,是临床治疗多重耐药菌感染的新思路.本文用五倍子提取液做消除剂对铜绿假单胞菌R质粒进行体外消除试验,结果如下.     

五倍子提取液对铜绿单胞菌R质粒体外消除作用的实验研究

铜绿假单胞菌是院内感染的主要致病菌1,带有耐药质粒的铜绿假单胞菌的大量存在,是造成这种情况的主要原因2。用人工方法使R质粒从宿主菌中消除,使其恢复对抗生素的敏感性,是临床治疗多重耐药菌感染的新思路。本文用五倍子提取液做消除剂对铜绿假单胞菌R质粒进行体外消除试验取得可喜进展。     

医院内感染耐药菌质粒的调查

目的：了解医院内感染耐药性菌质粒的分布情况。方法：运用质粒图谱,限制性内切酶谱,质粒消除,接合传递等系列补充实验对医院内感染细菌的R－质粒进行综合分析。结果：医院内感染以革兰氏阴性杆菌为主,占79．6％,其中71％的革兰氏阴性杆菌含R－质粒,DNA分子在2．3－23．1KB间,75．2％的铜绿假单胞菌经质粒消除后,对先锋V,庆大霉素,氨卞青霉素和羟卞青霉素由原来的耐药变为敏感,说明这部分细菌的抗药性是由质粒介导的。另外24．8％的菌株虽然质粒被消除了,但抗药性并未发生改变,铜绿假单胞菌20KB的质粒可转化到受体菌中,使受体菌带有铜绿假单胞菌相同的抗药性,表明这一质粒可在不同种属间传递,有成为“流行质粒”的倾向。结论：医院内感染以革兰氏阴性菌为主,质粒在耐药菌株的传播流行中起重要作用。     

射干提取液对铜绿假单胞菌PA11株R质粒体内外消除作用

目的 :以射干提取液为质粒消除剂 ,对铜绿脓假单胞菌 PA1 1株 R质粒进行体内外消除试验 ,使消除子恢复对抗生素的敏感性。方法 :取射干水煎剂对 PA1 1株进行最小抑菌浓度 ( MIC)试验 ,统计 MIC50 和 MIC90 。结果 :射干水煎剂对 PA1 1株 MIC为 31 .2 5 g· L-1,MIC50 为7.81 g·L-1,MIC90 为 1 5 .62 g· L-1。结论 :射干于体内外对铜绿假单胞菌有较强抑制作用     

苍术提取液对铜绿假单胞菌R质粒体外消除作用的实验研究

铜绿假单胞菌是院内感染的主要致病菌 ,带有耐药质粒的铜绿假单胞菌的大量存在 ,是造成这种情况的主要原因〔1〕。用人工方法使R质粒从宿主菌中消除 ,使其恢复对抗生素的敏感性 ,是临床治疗多重耐药菌感染的新思路。本文用苍术提取液做消除剂对铜绿假单胞菌R质粒进行体外消除实验 ,结果如下。1　材料与方法1 1　材料1 1 1　菌种 :铜绿假单胞菌为本组自临床绿脓杆菌感染患者体内分离并经系统鉴定的菌株 ,对GM、KM、TC均耐药。1 1 2　培养液 :营养琼脂为上海医学化验所产品。LB培养液每升含蛋白胨 10g ,酵母抽提物 5g ,葡萄糖 1g ,氯化钠 …     

海南省桶装饮用水中铜绿假单胞菌耐药性、T3SS毒力基因分布与同源性分析

目的 对海南省桶装饮用水中铜绿假单胞菌的耐药性及Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)毒力基因携带情况进行调查，在菌株核糖体分型基础上探讨其与样品来源及毒力基因之间的关系，为桶装饮用水的安全监管、污染溯源调查及耐药菌临床治疗提供数据基础。方法 使用VITEK 2 Compact全自动微生物药敏系统对分离得到的55株铜绿假单胞菌进行耐药性分析，通过PCR法扩增T3SS毒力基因ExoU、ExoS、ExoT、ExoY，并应用RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统对分离菌株进行鉴定分型及聚类同源性分析。结果 药敏结果显示，桶装饮用水中分离的铜绿假单胞菌菌株处于较低耐药水平，但仍然发现1株多重耐药铜绿假单胞菌，对亚胺培南、环丙沙星、头孢吡肟均耐药。T3SS毒力基因分布表现为4种基因型组合，分别为ExoT⁺/ExoY⁺/ExoS⁺/ExoU^-(45.45%,25/55)、ExoT⁺/ExoY⁺/ExoS^-...     

2011年我院铜绿假单胞菌耐药分析

目的 探讨铜绿假单胞菌(PA)的感染现状及对抗菌药物的耐药性,以利于临床合理用药.方法 对2011年1月1日～2011年12月20日分离的122株PA的分布状况和药敏试验结果进行回顾性分析.结果 122株铜绿假单胞菌中,耐药性最低的是亚胺培南(12.3%),阿米卡星(24.1%); 耐药性最高的是复方新诺明(85.2%),其次是哌拉西林(60.4%).结论 亚胺培南是治疗铜绿假单胞菌引起感染的可靠药物之一,随着耐亚胺培南菌株的增加,应了解铜绿假单胞菌的耐药机制,加强耐药监测,以便为临床提供可靠的依据,指导临床合理用药.     

铜绿假单胞菌对环丙沙星的抗药性和耐药性机制研究

目的研究铜绿假单胞菌对环丙沙星的抗药性(resistance)和耐药性(tolerance)机制,并予以区分。方法分离养殖场和医院铜绿假单胞菌33株,用微量肉汤稀释法测定铜绿假单胞菌临床分离株对喹诺酮类抗生素的最低抑菌浓度(MIC),筛选喹诺酮抗药菌5株;体外连续培养诱导铜绿假单胞菌标准菌株P.aeruginosa ATCC27853,得到对环丙沙星和头孢噻肟的高抗药性菌株PA34。检测及分析铜绿假单胞菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)的基因突变;荧光比色法检测不同抗药性表型的铜绿假单胞菌外排泵活性;荧光定量RT-PCR法检测铜绿假单胞菌外排泵、跨膜转运蛋白及喹诺酮靶酶编码基因的mRNA表达水平。结果 临床分离的5株喹诺酮抗药表型的铜绿假单胞菌,其外排泵活性均显著高于标准菌株(P<0.01),外排泵、喹诺酮靶位酶编码基因的mRNA的表达量上调、跨膜转运基因表达量下调,DNA旋转酶A亚基gyrA基因均发生点突变Thr-83→Ile。PA34和这5株抗药性菌株表现一致,但其MIC远高于这5株抗药性菌株,主要由于PA34除了gyrA基因发生点突变Thr-83→Ile外,parC基因发生多点突变Glu-84→Gln、Gln-91→Lys,且跨膜转运基因表达量极低。结论 在喹诺酮类抗生素选择压力下,铜绿假单胞菌能发展多种可能的机制以消除抗生素对细菌代谢的损伤,对类似gyrA、parC基因突变称为抗药性,其他生理性适应机制称为耐药性,其抗药性突变和耐药性调节共同决定了抗药性表型,但对其加以区分并分别研究,更容易集中研究单纯的抗药性突变机制,采取相应的用药措施。     

pvdQ基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

目的 观察pvdQ(PA2385)基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响.方法 构建pvdQ基因表达质粒pME6032-pvdQ,鉴定后,采用电穿孔法将其转入PAO1野生株中,构建pvdQ高表达株.同时将空质粒pME6032采用电穿孔法转入PAO1野生株中,构建pME6032空质粒株,采用Real-time PCR检测各株...     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

野生型p53基因对白血病K562细胞的增殖抑制作用

目的:建立携野生型p53基因的K562细胞株,研究该细胞内野生型p53基因的表达并观察其生物学特性。方法:构建重组人p53逆转录病毒载体,导入PA317细胞中进行包装,经过病毒滴度测定,筛选高滴度的产病毒细胞克隆。收集培养上清液中的重组人p53逆转录病毒颗粒,感染K562靶细胞,建立携野生型p53基因的K562细胞株。观察该细胞株的生长方式、形态学和生长速度。SP免疫组化染色法检测p53蛋白表达。进一步用流式细胞仪检测p53蛋白表达率和细胞周期变化;双层软琼脂培养实验检测细胞的增殖潜能改变。以pBabe空载体同时实验,作为各阶段的对照。结果:成功地构建了重组逆转录病毒载体pBabe/p53;获得逆转录病毒生产PA317/p53细胞系,最高病毒滴度为4.64×105CFU/m l;获稳定表达p53基因的K562/p53靶细胞,免疫组化结果证实该细胞内有野生型P53蛋白表达,流式细胞仪检测到野生型P53蛋白表达率为1.32%;与对照K562/pBabe细胞比较,K562/p53靶细胞的生长速度下降;软琼脂集落生成的下降率为27.14±4.49%(P<0.05);增殖指数下降,S期比例下降(P均<0.01)。结论:制备了携p53基因的高滴度逆转录病毒,建立携野生型p53基因的K562/p53细胞株,证实表达的野生型p53蛋白对该细胞有抑制作用。     

穿梭质粒pCDHl-GFP-HCN4的构建及HCN4重组慢病毒的包装

目的将全长约3．6kb的HCN4目的基因片段从pCDNA3-HCN4质粒卸载下来,建立稳定的HCN4重组慢病毒。方法用EcoRI和XbaI从pCDNA3-HCN4质粒切下HCN4目的片段连接到Pucl9载体中,再用EcoRI和饿蒯Ⅲ从质粒Pucl9切下目的片段并连接到pcDNA3．1（A）载体中,再用XbaI单酶从质粒pcDNA3．1（A）双切到pCDHl-MCSl-EFl-copGFP中。用XbaI或者EcoRI鉴定,将阳性克隆质粒送上海生工测序,慢病毒的包装参照SBI的LentivectorExpressionSystem操作手册进行。将构建好的慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞及心肌样骨髓基质干细胞。结果（1）XbaI及EcoRI鉴定表明,PCR产物和克隆扩增产物的电泳结果显示该基因的大小约为3．6kb;阳性克隆质粒测序结果与GENEBANK目的基因HCN4序列完全相同;构建的目的基因质粒转染293细胞和原代猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光出现。（2）构建的慢病毒包装质粒混合物转染293细胞后,发现有强烈的绿色荧光出现,细胞感染率达90％以上。结论（1）成功将全长HCN4目的基因片段从pCDNA3-HCN4质粒卸载下来,成功构建穿梭质粒pCDHl-MCSl-EFl-copGFP。（2）成功建立稳定的HCN4重组慢病毒,该病毒载体有很高的转染效率。     

人胰岛素原基因的包装及增殖

目的:用PA317包装细胞包装突变人胰岛素基因原质粒,并检测其增殖情况.方法:用脂质体转染法将PLXSN-MPINS质粒转染至PA317包装细胞,用G418筛选出阳性PA317包装细胞克隆并测定胰岛素原基因浓度,用TRIZOL法提取未转染和转染后PA317细胞的基因组DNA,PCR检测突变人胰岛素基因的整合情况.结果:(1)用脂质体转染法获得G418阳性PA317包装细胞克隆;(2)该细胞克隆获高滴度的胰岛素原基因浓度;(3)PCR方法在转染后PA317基因组中检测到突变人胰岛素原基因.结论:脂质体转染法是一种操作简便且行之有效的转染方法.PA317包装细胞系可成功包装突变人胰岛素原基因质粒并可获得高滴度表达,为1型糖尿病基因治疗的进一步实验研究奠定了基础.     

先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8突变型和野生型在真核细胞中的蛋白表达

目的 克隆一个先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8,研究该基因野生型(wGJA8)和突变型(mGJA8)在体外真核细胞系中的表达.方法 以正常人类和家系患者基因组DNA为模板进行PCR扩增,分别调取wGJA8和mGJA8.构建质粒pEGFP-N1-wGJA8和pEGFP-N1-mGJA8,经双酶切测序鉴定后分别转染COS7细胞,用荧光显微镜观察蛋白表达情况,Western印迹和免疫组化法检测蛋白表达.结果 目的 基因wGJA8和mGJA8克隆成功,经双酶切和DNA测序证实质粒pEGFP-N1-wGJA8和pEGFP-N1-mGJA8构建成功.荧光显微镜观察到野生型蛋白和突变型蛋白在体外培养的COS7细胞内均有表达,Western印迹和免疫组化显示基因wGJA8和mGJA8在COS7细胞中均有蛋白表达.结论 成功克隆出该家系致病基因wGJA8和mGJA8,完成了致病基因在真核细胞中的蛋白表达,为进一步研究该家系白内障的确切发病机制奠定了基础.     

脂质体介导p53基因对肝癌细胞生长的抑制作用

观察外源野生型p5 3基因在肝癌基因治疗方面的可行性。方法 :将载有人野生型 p5 3-cDNA的真核表达质粒pcDNA3 - p5 3,用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG3B细胞 ,用流式细胞仪检测pcDNA3-p5 3对HepG3B细胞生长的影响。结果 :通过观察细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数发现 ,HepG3B细胞生长受到明显的抑制。结论 :脂质体介导的p5 3基因可在HepG3B细胞中表达 ,且明显抑制该细胞的生长。     

AKT2 3′-UTR荧光素酶报告基因载体构建及与miRNA-625靶向关系验证

目的: 通过构建荧光素酶报告基因重组质粒验证miRNA-625与AKT2基因的靶向调控关系。方法: 通过生物信息学软件预测AKT2为miRNA-625靶基因;构建野生型AKT2基因3′端非翻译区荧光素酶报告基因载体及miRNA-625靶序列突变型载体;将HEK-293T细胞株随机分为野生型+miRNA-625组、野生型+miRNA内参组、突变型+miRNA-625组、突变型+miRNA内参组;Lipofectamine 2000转染相应的质粒与miRNA,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果： 构建野生型及突变型荧光素酶报告载体鉴定正确,双荧光素酶报告基因检测系统显示野生型+miRNA-625组相对荧光素酶活性较野生型+miRNA内参组明显降低(t=14.176 4,P<0.05)。结论： miRNA-625对野生型AKT2重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miRNA-625能够靶向调控AKT2基因。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

蹭行运动和胞外藻酸盐在铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用

目的 比较3株铜绿假单胞菌即含新的mucA基因突变的黏液型PA17、mucA基因经典突变的黏液型PD0300、含野生型mucA基因的非黏液型PA01生物被膜早期形成和成熟形态,探讨铜绿假单胞菌纤毛介导的蹭行运动和胞外基质藻酸盐在黏液型及非黏液型铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用.方法 用PAl7、PAO1、PD0300的单菌落穿刺接种1%琼脂糖平板,肉眼观察细菌纤毛介导的蹭行运动,测定细菌运动环评估3株细菌的蹭行运动能力;在生物被膜形成早期采用结晶紫对膜内黏附细菌染色,测定其吸光度(A)值,建立24 h内3株细菌的黏附曲线;建立未饱和铜绿假单胞菌生物被膜模型,检测早期和成熟期的胞外藻酸盐分泌;将含绿色荧光蛋白的pUCP/UV质粒转化3株铜绿假单胞菌,在激光共聚焦显微镜下观察静态生物被膜不同时期的形态和结构.结果 黏液型PA17、非黏液型PAO1菌株蹭行运动的直径小于黏液型PDO300(P<0.05),PA17、PAO1的运动能力弱于PDO300菌株;黏液型PDO300在早期生物被膜形成中黏附能力最强,非黏液型PAO1次之,黏液型PA17最弱;在未饱和生物被膜早期和成熟期黏液型菌株PA17、PDO300藻酸盐合成均明显高于非黏液型菌株PAO1(P<0.05),而PA17和PDO300在生物被膜相同时期的藻酸盐合成无明显差异(P>0.05);激光共聚焦显微镜下PA17菌株在生物被膜形成中,不可逆黏附形成明显迟于非黏液型PAO1和黏液型PDO300,PA17成熟生物被膜形态呈薄膜状,与非黏液型PAO1成熟生物被膜类似;而PDO300不可逆黏附形成早,成熟生物被膜形态呈蘑菇状.结论 纤毛介导的蹭行运动是早期生物被膜形成中黏附的重要方式,可能影响成熟生物被膜的形态;而藻酸盐不是早期黏附的主要决定因素,与成熟生物被膜形态无关.