铜绿假单胞菌临床分离株的耐药性分析

目的:了解临床分离的铜绿假单胞菌的耐药特征,为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法:回顾性调查并分析我院近3年铜绿假单胞菌的临床分离情况及其耐药特征。结果:近3年临床分离出铜绿假单胞菌1287株,占革兰阴性(Gˉ)杆菌的21%,药敏结果显示,对亚胺培南、美洛培南及β-内酰胺酶抑制剂耐药率增加(>20%),对其他β-内酰胺类、氨基糖苷类及喹诺酮类的耐药率较高(>30%),仅对头孢他啶和阿米卡星保持较高的敏感率(>75%)。结论:铜绿假单胞菌对碳青霉烯类及β-内酰胺酶抑制剂敏感性下降,对多种药物耐药率较高,应合理应用抗菌药物,加强耐药性监测。     

促凋亡蛋白Smac和Caspase9在内毒素诱导体外肝细胞凋亡中的作用

目的 探讨内毒素致肝细胞凋亡和内毒素血症在重症肝炎发病中的作用机制.方法 培养L02肝细胞并进行传代,采用内毒素10 mg/ml分别在4小时、8小时、16小时和24小时进行刺激,并将其分为4小时、8小时、16小时和24小时组和对照组5组,采用流式细胞术和荧光染色检测肝细胞凋亡以及免疫组化法检测Smac和Caspase9的表达.结果 内毒素直接作用的L02细胞在形态学上表现出胞浆浓缩核凝聚成团块、形成凋亡小体,应用Hcechst对内毒素刺激的L02细胞进行染色并在荧光显微镜下观察,Hcechst染色显示凋亡细胞呈蓝色荧光.流式细胞仪分析内毒素刺激4小时、8小时、16小时和24小时后晚期凋亡率分别为2.3%、4.0%、6.2%和18.2%,呈进行性增高(P<0.01),与对照组晚期凋亡率(0.3%)比较有显著性差异(P<0.05),Smac和Caspase9蛋白随着刺激时间的增长表达率逐渐增高(P<0.01),与对照组比较,各刺激组Smac和Caspase9蛋白表达显著增高(P<0.05).各组Smac与Caspase9蛋白表达呈正相关关系(r=0.527,P<0.001).且Smac和Caspase9蛋白在胞浆中呈棕黄色表达.结论 内毒素在体外可以通过促凋亡蛋白Smac及增强下游通路Caspase9的活性直接诱导正常肝细胞凋亡.     

新型mucA基因突变对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响

目的 研究新型突变的mucA基因对黏液型铜绿假单胞菌PA17生物被膜形成过程和成熟生物被膜形态的影响.方法 将PAO1的mucA基因全长克隆到铜绿假单胞菌表达质粒pUCP20上,转化到含新型mucA基因突变的黏液型铜绿假单胞菌PA17,酶切、测序鉴定;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒表达,半定最逆转录(RT)-PCR检测IPTG诱导前后藻酸盐合成关键基因algD的表达水平;改良平板培养法建立PA17、含重组质粒的PA17及PAO1的生物被膜模型,扫描电镜观察其生物被膜形成过程.结果 IPTG诱导后,表达重组质粒的PA17浮游状态时algD表达下降,证实PAO1的mucA基因转化PA17成功,其生物被膜形成速度居PAO1和PA17之间,8 h时即可出现不可逆性黏附,6 d形成成熟生物被膜,PA17、PAO1和含重组质粒的PA17所形成的成熟生物被膜形态相似.结论 PA17所含的新型mucA基因突变造成PA17生物被膜形成初始阶段的不可逆黏附过程延迟,但对成熟生物被膜形态无影响.     

蹭行运动和胞外藻酸盐在铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用

目的 比较3株铜绿假单胞菌即含新的mucA基因突变的黏液型PA17、mucA基因经典突变的黏液型PD0300、含野生型mucA基因的非黏液型PA01生物被膜早期形成和成熟形态,探讨铜绿假单胞菌纤毛介导的蹭行运动和胞外基质藻酸盐在黏液型及非黏液型铜绿假单胞菌生物被膜形成中的作用.方法 用PAl7、PAO1、PD0300的单菌落穿刺接种1%琼脂糖平板,肉眼观察细菌纤毛介导的蹭行运动,测定细菌运动环评估3株细菌的蹭行运动能力;在生物被膜形成早期采用结晶紫对膜内黏附细菌染色,测定其吸光度(A)值,建立24 h内3株细菌的黏附曲线;建立未饱和铜绿假单胞菌生物被膜模型,检测早期和成熟期的胞外藻酸盐分泌;将含绿色荧光蛋白的pUCP/UV质粒转化3株铜绿假单胞菌,在激光共聚焦显微镜下观察静态生物被膜不同时期的形态和结构.结果 黏液型PA17、非黏液型PAO1菌株蹭行运动的直径小于黏液型PDO300(P<0.05),PA17、PAO1的运动能力弱于PDO300菌株;黏液型PDO300在早期生物被膜形成中黏附能力最强,非黏液型PAO1次之,黏液型PA17最弱;在未饱和生物被膜早期和成熟期黏液型菌株PA17、PDO300藻酸盐合成均明显高于非黏液型菌株PAO1(P<0.05),而PA17和PDO300在生物被膜相同时期的藻酸盐合成无明显差异(P>0.05);激光共聚焦显微镜下PA17菌株在生物被膜形成中,不可逆黏附形成明显迟于非黏液型PAO1和黏液型PDO300,PA17成熟生物被膜形态呈薄膜状,与非黏液型PAO1成熟生物被膜类似;而PDO300不可逆黏附形成早,成熟生物被膜形态呈蘑菇状.结论 纤毛介导的蹭行运动是早期生物被膜形成中黏附的重要方式,可能影响成熟生物被膜的形态;而藻酸盐不是早期黏附的主要决定因素,与成熟生物被膜形态无关.     

同源重组构建铜绿假单胞菌新的mucA基因突变菌株

目的 构建铜绿假单胞菌新的mucA基因突变菌株,为研究新突变的mucA基因功能提供实验菌株.方法 首先将含新突变的mucA基因同源片段与自杀质粒pEX100T相连接,构建质粒pEXmucA56,再将质粒pEXmucA56转化人大肠埃希菌DH5α,与铜绿假单胞菌标准菌株PAO1共培养进行同源重组,并用羧苄青霉素(Carbenicillin)平板、假单胞菌分离平板(Pseudomonas isolation agar,PIA)和蔗糖(sucrose)平板进行筛选,获得染色体上含新突变的mucA基因的PAO1菌株.结果 经酶切及聚合酶链反应(polyrnerase chain reaction,PCR)鉴定质粒pEXmucA56构建及转化成功,经PCR及测序分析证实同源重组菌株PAOmucA56构建成功.结论 成功构建了含新的mucA基因突变的铜绿假单胞菌菌株PAOmucA56,为研究新突变的mucA基因的功能奠定了基础.     

全反式维甲酸对抗肾小球基底膜肾炎小鼠模型肾脏损害的保护作用

目的探讨全反式维甲酸对肾毒性血清肾炎(NTSN)小鼠模型的作用及机制。 方法使用肾毒性血清(NTS)尾静脉注射构建NTSN模型，设置对照组、NTS组、NTS＋维甲酸组。NTS注射前5 d给予羊免疫球蛋白和完全弗氏佐剂腹腔注射预处理，预处理后24 h给予16 mg/kg全反式维甲酸或溶媒腹腔注射，NTS注射后7 d处死小鼠。ELISA法检测小鼠白蛋白尿/肌酐比值、小鼠BUN；肾组织石蜡切片HE染色，定量分析新月体肾炎、肾小球节段硬化的百分比；肾组织冰冻切片行CD8^＋、CD4^＋、CD68免疫荧光染色，并定量分析；QPCR方法分析肾皮质炎症细胞趋化因子如人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、淋巴细胞趋化因子(LTN)的表达量。 结果维甲酸处理组显著减轻肾毒性血清肾炎小鼠模型的蛋白尿[NTS组和NTS＋维甲酸组尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)分别为：(4.52±0.36)×10^－3mg/g、(2.63±0.18)×10^－3mg/g；q＝18.45，P< 0.01]、肾功能[NTS组和NTS＋维甲酸组BUN分别为：(16.81±1.23)mmol/L、(13.33±0.62)mmol/L；q＝6.155，P<0.01]、减轻肾组织病变[NTS组和NTS＋维甲酸组含新月体的肾小球百分比分别为：[(36±1.58)%、(22.2±1.92)%；q＝21.46，P<0.01]。维甲酸处理组每低倍镜视野下CD8^＋淋巴细胞计数、CD4^＋淋巴细胞计数、每高倍镜视野下CD68阳性细胞面积较NTS组均明显减少，差异有统计学意义(q值分别为：9.545、8.610、11.08；P<0.01)；维甲酸可以显著抑制炎症细胞趋化因子(MCP-1、ICAM-1、LTN)的基因表达。 结论维甲酸通过抑制炎症细胞趋化因子的表达、减少炎症细胞的浸润，减轻NTSN小鼠模型的蛋白尿、新月体形成等肾损害。     

三株黏液型铜绿假单胞菌的生物学特性研究

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）是慢性呼吸道感染的重要致病菌。根据其形态和是否大量产生藻酸盐可分为黏液型和非黏液型。黏液型铜绿假单胞菌由于大量产生藻酸盐而更易形成生物被膜，使其逃逸机体免疫清除和增强对抗菌药物的耐药性，给临床治疗带来极大的困难。研究表明，mucA基因突变是造成铜绿假单胞菌发生黏液型转换的主要机制。目前已发现的mucA基因突变类型有多种，mucA基因突变类型对黏液型铜绿假单胞菌的生物学特性极可能造成较大影响。[第一段]     

湖北地区2000～2007年铜绿假单胞菌临床分离株的耐药性分析

目的了解湖北地区临床分离的铜绿假单胞菌的耐药变迁,为临床合理使用抗生素提供依据。方法综合分析湖北地区17家医院2000～2007年的铜绿假单胞菌分离情况及其对各种抗生素的耐药率。结果湖北地区铜绿假单胞菌的年分离量和对各抗生素的耐药率基本呈逐年上升的趋势,对头孢唑啉、头孢呋辛的耐药率几乎达100％,对头孢曲松、头孢噻肟的耐药率〉50％,对庆大霉素、加替沙星的耐药性大大增加（耐药率在40％～50％之间）,对环丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南、哌拉西林、他唑巴坦保持中度敏感性（耐药率在30％--40％之间）,对阿米卡星、头孢哌酮／舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、亚氨培南、美洛培南保持相对较好的敏感性（耐药率〈30％）。结论铜绿假单胞菌对各种抗生素的耐药性逐年增加,临床上应选择敏感性相对较好的药物作为铜绿假单胞菌的经验用药,以避免医疗成本的浪费及耐药性加剧。     

藻酸盐影响庆大霉素对铜绿假单胞菌生物被膜渗透性及杀菌活性的研究

目的:探讨藻酸盐对氨基糖苷类抗生素庆大霉素对铜绿假单胞菌的渗透性及杀菌活性的影响。方法:选择经典突变黏液菌株(PDO300)和标准非黏液菌株(PAO1)作为实验菌株,PIA平板观察细菌的黏液表型;色氨酸反应法测定其胞外多糖蛋白复合物的产量;NCCLS推荐的琼脂稀释法测定两菌株对庆大霉素的MIC;分别检测两菌株在浮游状态和生物被膜状态对庆大霉素的敏感性;"三明治夹心法"检测两菌株生物被膜状态下对庆大霉素的渗透性。结果:PDO300表现出明显的黏液表型,较PAO1的多糖蛋白复合物产量明显增高。两者对庆大霉素的MIC均为2μg/ml,浮游状态下两者对20μg/ml庆大霉素敏感性一致。生物被膜24h的渗透率PAO1为90%,而PDO300为50%。PDO300对20μg/ml庆大霉素的敏感性明显降低。结论:藻酸盐可以显著降低庆大霉素对铜绿假单胞菌生物被膜的渗透性及杀菌活性。     

亚胺培南／西司他丁对铜绿假单胞菌生物膜形成和藻酸盐合成基因表达的影响

目的：研究亚胺培南／西司他丁对黏液型铜绿假单胞菌PA17及非黏液型铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成及其藻酸盐合成基因algD表达的影响。方法：试管倍比稀释法检测亚胺培南／西司他丁对PA17和PAO1的最低抑茵浓度（MIC）；改良平板培养法建立PA17和PAO1的生物膜模型，从微菌落形成阶段开始在生物膜培养基中分别加入1倍和10倍最低抑菌浓度的亚胺培南／西司他丁，扫描电镜观察PA17和PAO1生物膜形成的变化，半定量RTPCR检测加入亚胺培南／西司他丁对生物膜形成过程中algD基因表达水平的影响。结果：对PA17用1倍和10倍MIC的亚胺培南／西司他丁干预时，第3天algD表达较对照组分别增加1．5和3．4倍，生物膜形态无明显变化；第6天algD表达分别增加0．38和0．78倍，没有形成生物膜。对PA01用1倍和10倍MIC的亚胺培南／西司他丁干预时，第24小时algD表达较对照组分别增加2．5和3．5倍，生物膜形态无明显变化；第3天algD分别增加0.7和2.1倍，1倍MIC干预组仍可看到少量微菌落存在，10倍MIC干预组仅见散在的细菌；第6天algD分别增加1．5和2．1倍，两个浓度组均只见数个细菌黏附于盖玻片。结论：亚胺培南／西司他丁对黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌algD表达和生物膜形成的作用一致，虽可诱导algD表达上调从而使藻酸盐合成增加，但若从生物膜形成早期开始使用，仍可抑制和破坏生物膜形成。