缺氧促进牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达

目的探讨缺氧对视网膜血管内皮细胞VEGF表达的影响。方法采用细胞克隆、机械除杂法培养视网膜血管内皮细胞;四唑盐比色试验(MTT)比较正常和缺氧状态下牛视网膜血管内皮细胞的细胞数目。应用ELISA法检测正常和缺氧状态下牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达。缺氧状态下加入VEGF抗体后,检测VEGF的表达。结果正常状态下即可检测到VEGF的表达。缺氧状态下,牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达显著增加(P<0.01)。结论缺氧环境能刺激培养的牛视网膜血管内皮细胞的增殖。缺氧能刺激培养的牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达。     

血管抑素体外对兔视网膜微血管内皮细胞增生的抑制

目的 观察血管抑素对体外培养的兔视网膜微血管内皮细胞生长的抑制作用及对细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK-1)活化的影响。方法 利用L-Lysine耦联的Sepharose 4B亲和层析柱从血浆中分离和纯化血管抑素。原代培养兔视网膜微血管内皮细胞，MTT法检测不同浓度的血管抑素对其生长的抑制作用，Western blot检测血管抑素对血管内皮细胞生长因子刺激的视网膜微血管内皮细胞ERK-1水平的影响。结果 血管抑素在体外能显著抑制视网膜微血管内皮细胞增生，其ED50约为160μg／ml。VEGF刺激兔视网膜微血管内皮细胞后，ERK-1被迅速激活，而血管抑素能使其表达量降低35．6％。结论 血管抑素有望成为极有临床价值的防治视网膜新生血管形成的新药。     

人脐静脉内皮细胞的培养和连续传代

本实验用新生小牛视网膜提取物作血管内皮细胞生长促进剂，成功地使人脐静脉内皮细胞在体外连续培养23代以上。细胞倍增时间平均为16．6h，细胞传代时间平均为5d，传代比率为1：2～1：3。用ABC法证明细胞内存在Ⅷ因子相关抗原(Ⅷr-Ag)，透射电镜下可见胞浆内含WP(Weibel-Palade)小体，证实所培养的细胞为血管内皮细胞。     

人脂肪间充质干细胞体外分化为视网膜细胞观察

目的:研究成人脂肪间充质干细胞(hAD-MSC)体外诱导分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)、光感受器细胞和血管内皮细胞的情况.方法:分离、培养和鉴定hAD-MSC,用血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子诱导hAD-MSC向血管内皮细胞分化,并检测血管内皮细胞标志物血管内皮细胞Ⅷ因子(vWF)的表达情况.制备hAD-MSC体外诱导液,用诱导剂和诱导液共同诱导hAD-MSC向视网膜细胞分化,采用免疫荧光法检测hAD-MSC经诱导后表达光感受器细胞标志物视紫红质(Rhodopsin)和RPE细胞标志细胞角蛋白(Pan-CK)的表达情况.结果:免疫荧光法证实,分离培养的hAD-MSC经体外诱导后可表达RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞的标志Pan-CK、Rhodopsin和vWF.结论:hAD-MSC经过体外诱导可以向视网膜RPE、光感受器细胞和血管内皮细胞分化.     

兔肾微血管内皮细胞的体外培养及鉴定方法

目的 探索肾微血管内皮细胞的体外培养方法，为骨组织工程再血管化提供理想的种子细胞；方法 采用三步梯度筛网法，先获得较高纯度的肾血管球，再应用肾血管球外植法体外培养肾微血管内皮细胞；并对肾微血管内皮细胞进行Ⅶ因子相关抗原免疫组化鉴定和透射电镜观察。结果 体外培养出纯度很高的血管内皮细胞并培养了10代；Ⅷ因子相关抗原免疫组化阳性，透射电镜检测出W-P小体。结论 该法可成功培养出肾微血管内皮细胞。     

豚鼠血管内皮细胞培养的研究

目的：建立稳定的豚鼠血管内皮细胞原代及传代培养方法,并保证豚鼠取材后较高的存活率。方法：采用自豚鼠一侧颈总动脉取材进行血管内皮细胞培养,克服了以往小动物血管内皮细胞培养自大血管取材,取材后动物均死亡的缺点,由于颈总动脉管腔细小,原代培养获取细胞数少,培养不易成功,采用新的血管外翻方法进行酶消化获取内皮细胞,并创造有利于细胞生长的最适条件。结果：血管内皮细胞扩增迅速,纯度较高,为进一步研究了奠定基础。结论：自豚鼠颈总动脉取材进行血管内皮细胞培养能够获得令人满意的结果。     

一种高选择性、高效的牛视网膜微血管内皮细胞培养方法

目的 建立一种高效、可行、特异性高的牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)培养方法.方法 取新鲜牛眼,分离视网膜并用DMEM进行冲洗、匀浆剪碎,过75μm筛,将滤网上滤渣转移至50 ml离心管,用I型胶原酶、DNaseI及蛋白酶等多种酶混合液消化20 min,人血清中和后,过46μm网筛并冲洗,离心5 min,将组织扣在培养皿中,转入15 ml离心管,用10％人血清含生长因子ECGS的DMEM培养液培养于25 cm2,选择性培养视网膜血管内皮细胞,接种于明胶包被培养瓶中,采用ECGS配合肝素培养液促进内皮细胞生长,观察细胞形状生长特性,并用免疫化学荧光方法进行鉴定.结果 选择性培养视网膜微血管内皮细胞成单层、镶嵌铺路石状生长,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测为阳性纯度均大于95％以上,将细胞种在凝固的基质胶表面,12～18 h形成官腔结构.结论 本方法过程简单、可靠,培养的内皮细胞纯度高,生长状态良好,稳定传代,为视网膜血管生成疾病研究建立了模型.     

橙皮苷防治糖尿病视网膜病变药效及网络药理学机制研究

目的观察橙皮苷对高糖诱导的视网膜血管内皮细胞的影响,并运用网络药理学及分子对接探讨其分子机制。方法在高糖环境下培养视网膜血管内皮细胞,检测橙皮苷对高糖条件下细胞迁移和试管形成的影响。利用Pubchem、Swisstarget和PharmGKB等数据库检索橙皮苷抗糖尿病视网膜病变潜在作用靶点,通过DAVID数据库进行富集分析,采用Accelrys Discovery Studio Client 2.5将橙皮苷和靶蛋白进行分子对接。结果橙皮苷可减少视网膜内皮细胞的迁移数量,同时降低细胞成管能力。网络药理学结果显示,橙皮苷抗糖尿病视网膜病变靶点共17个,KEGG通路富集得到8条信号通路。结论橙皮苷可以抑制高糖诱导下内皮细胞迁移和管道形成,提示橙皮苷可能具有防治糖尿病视网膜病的药效,其机制可能与影响表皮生长因子受体、血管内皮生长因子-A、雌激素受体1和雌激素受体2等有关。     

人脐静脉内皮细胞的培养和连续传代

本实验用新生小牛视网膜提取物作血管内皮细胞生长促进剂,成功地使人脐静脉内皮细胞在体外连续培养23代以上。细胞倍增时间平均为16.6h,细胞传代时间平均为5 d,传代比率为1:2～1:3。用ABC法证明细胞内存在Ⅷ因子相关抗原(FⅧr-Ag),透射电镜下可见胞浆内含WP(Weibe1-Palade)小体,证实所培养的细胞为血管内皮细胞。     

川芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞ATP分泌的影响

目的探讨川芎嗪对缺氧牛视网膜血管内皮细胞中ATP含量的影响。方法用酶消化法分离牛眼视网膜血管内皮细胞,进行形态学的观察并用Ⅷ相关免疫组化法鉴定。取3代的细胞用于实验。细胞分组：取常规培养的第3代细胞,分为5组：正常对照组（F12培养基常规培养）,缺氧组（加入终浓度125μmmol/L的CoCl2）和缺氧加药物组（加入含20、40、120μg/ml川芎嗪）。免疫组化法和生物荧光法分别检测川芎嗪对CoCl2诱导的缺氧的牛视网膜血管内皮细胞中ATP含量。结果缺氧BREC细胞ATP含量增加,而川芎嗪可减少缺氧引起的ATP浓度升高,且呈剂量依赖性。当川芎嗪浓度为20μg/ml时,其ATP含量水平已显著下降（P〈0.01）。结论川芎嗪可减少缺氧诱导的血管内皮细胞ATP含量增加。     

牛视网膜毛细血管周细胞的原代培养

目的：建立牛视网膜毛细血管周细胞原代培养的方法。 方法：以酶消化法原代培养牛视网膜毛细血管周细胞,用透射电镜和免疫细胞化学法对细胞 进行鉴定。 结果：培养的周细胞贴壁生长,胞体肥大,呈不规则状、有较多突起。细胞生长缓慢,呈现非接触抑制的重叠状生长。电镜下周细胞核大、不规则、有切迹,可见多个核仁。细胞表面有微绒毛,胞质内有丰富的细胞器,无Ⅷ因子小体;免疫细胞化学显示细胞呈平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性,Ⅷ因子相关抗原阴性。 结论：酶消化法原代培养牛视网膜周细胞是一种稳定、可靠的方法。     

高糖对牛视网膜微血管内皮细胞损伤的实验研究

目的　利用体外培养的牛视网膜微血管内皮细胞来观测高浓度葡萄糖在细胞的损伤中所起的作用。方法体外培养牛视网膜微血管内皮细胞。通过MTT (四唑氮盐 )法及3 H -TDR掺入法研究高糖对牛视网膜微血管内皮细胞的损伤作用。结果　内皮细胞在含高糖 (2 8、 4 0mmol/L)DMEM培养基及不同培养时间 (2d、 7d)下MTT测定结果与对照组 (生理浓度葡萄糖 ,5 5mmol/L)比较有显著性差异P <0 0 5 ,3 H -TDR掺入法研究结果显示高糖对视网膜微血管内皮细胞的增殖有明显抑制作用 ,亦呈剂量及时间依赖性损伤细胞。结论　高浓度葡萄糖对牛视网膜微血管内皮细胞有显著的损伤作用     

DIFFERENT RESPONSES OF CHORIOCAPILLARY ENDOTHELIAL CELLS AND RETINAL CAPILLARY ENDOTHELIAL CELLS TO MITOGENIC AND VASOACTIVE

ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＲＥＳＰＯＮＳＥＳＯＦＣＨＯＲＩＯＣＡＰＩＬＬＡＲＹＥＮＤＯＴＨＥＬＩＡＬＣＥＬＬＳＡＮＤＲＥＴＩＮＡＬＣＡＰＩＬＬＡＲＹＥＮＤＯＴＨＥＬＩＡＬＣＥＬＬＳＴＯＭＩＴＯＧＥＮＩＣＡＮＤＶＡＳＯＡＣＴＩＶＥＦＡＣＴＯＲＳ￥ＬｉＷｅｉｙｅ...     

血小板反应蛋白-1在糖尿病大鼠视网膜微血管中的表达

目的研究高糖状态下血小板反应蛋白-1(TSP-1)在视网膜微血管中的表达。方法链脲佐菌素腹腔注射诱导建立大鼠糖尿病动物模型,设立正常对照组。体外培养牛视网膜微血管内皮细胞,免疫组化法进行鉴定。分别于建模后2、4、8周,运用免疫组化及Western blotting检测大鼠视网膜中TSP-1的表达。收集不同时段高糖孵育的内皮细胞,Real-time PCR检测TSP-1mRNA表达的变化。结果TSP-1在糖尿病大鼠视网膜组织的表达随病程而增加;在正常对照组中,TSP-1的表达呈现生理性的年龄-相关性增长,其增加程度远低于相应周龄的糖尿病大鼠。高糖孵育内皮细胞48 h时,TSP-1 mRNA较正常对照增高,在高糖作用5 d时反而下降(P<0.05)。结论TSP-1对维持血管稳态起重要作用。在高糖状态下,TSP-1高表达可能对新生血管的形成起到重要的负反馈作用。     

重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子体外抗血管内皮细胞增殖的活性

目的：研究重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）体外抗血管内皮细胞增殖的活性。方法：MTT法检测重组人可溶性VEGI对血管内皮细胞及肿瘤细胞增殖的抑制活性。结果：在体外,重组人可溶性BEGI可强烈抑制人脐静脉内皮细胞ECV304、大鼠肺源毛细血管内皮细胞（MPCEC）及新生牛主动脉内皮细胞（BAEC）的增殖,不能报制黑色素瘤细胞B－16和小鼠成纤维细胞L－929的增殖。结论：重组人可溶性VEGI能作用于不同来源的血管内皮细胞,而对肿瘤细胞增殖无抑制作用,提示其可能通过抗肿瘤新生血管生成而发挥抗肿瘤作用。     

氨基胍对STZ糖尿病大鼠视网膜毛细血管超微结构的影响

目的观察病程6月STZ糖尿病大鼠视网膜毛细血管超微结构的病理改变及氨基胍对超微结构改变的影响。方法制备STZ糖尿病大鼠动物模型，随机分为正常对照(CON)组、糖尿病(13M)组及氨基胍(AG)组。每组大鼠各8只，饲养6个月时处死，取大鼠视网膜进行电镜观察。结果DM组视网膜周细胞、内皮细胞核染色质浓缩，边集，分布于核膜下；胞质内线粒体肿胀，变性，空泡化，胞浆消失；基底膜增厚。结论氨基胍对STZ糖尿病大鼠视网膜毛细血管超微结构的损害有明显防治作用。     

糖尿病大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡——TUNEL法研究

目的： 确定早期糖尿病视网膜病变 （糖网病） 大鼠视网膜毛细血管细胞凋亡并观察凋亡特征。方法： 选成年ｗ ｉｓｔａｒ大鼠４０ 只, 随机分成正常对照（ Ｃ Ｏ Ｎ）、糖尿病１ 月 （ Ｄ Ｍ１）、３ 月 （ Ｄ Ｍ３） 及６ 月 （ Ｄ Ｍ ６） 组。采用链脲佐菌素腹腔内注射诱发大鼠糖尿病。取各组大鼠视网膜制备血管铺片, Ｔ Ｕ Ｎ Ｅ Ｌ法标记, 光镜观察。结果： Ｔ Ｕ Ｎ Ｅ Ｌ法标记的阳性周细胞核出现于 Ｄ Ｍ３ 和 Ｄ Ｍ６ 组,而内皮细胞见于 Ｄ Ｍ ６ 组。 Ｃ Ｏ Ｎ 和 Ｄ Ｍ１ 组未见阳性反应细胞。被标记的周细胞核小而圆, 位于毛细血管侧面, 稍突出于血管壁。而内皮细胞核大而呈现椭圆形, 位于毛细血管中央, 与血管平行, 阳性反应细胞染色质分布不均, 表现为环形核、新月形核等典型的凋亡细胞特征。结论： 早期糖网病大鼠视网膜毛细血管周细胞丧失的性质为细胞凋亡, 内皮细胞亦存在凋亡。     

糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡及相关基因的表达

目的　探讨大鼠早期糖尿病视网膜毛细血管细胞凋亡 ,并观测凋亡相关基因 (Bax、Bcl 2 )的表达。方法　选择健康成年Wistar大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素 (STZ)诱发大鼠糖尿病 ,将视网膜血管网和眼杯进行染色后 ,镜下观察。结果　TUNEL法标记的阳性周细胞核染色质分布不均 ,表现为环形、新月形核等典型的凋亡细胞特征 ;ABC法染色发现Bax和Bcl 2基因蛋白均存在视网膜血管表达。结论　早期糖尿病大鼠视网膜、毛细血管周细胞丧失的性质为细胞凋亡 ,内皮细胞亦存在凋亡 ,Bax和Bcl 2表达增强     

纤溶酶原Kringle5缺失突变体抑制血管内皮细胞增生的研究

目的 纤溶酶原蛋白水解片段Kringle5(K5)具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值，但是K5已获得美国专利。本研究应用基因突变和基因重组技术获得缺失突变型(K5Mutl)并检测其体外活性。方法 除去K5外环两端的N端和C端15个氨基酸残基以降低其相对分子质量，但同时保留K5分子中的所有3个二硫键以保留完整的外环结构域，并在大肠杆菌中表达，亲和层析纯化，获得突变型K5Mutl(Cysl-80)；MTT法分析突变型K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞和周皮细胞的抑制作用。结果 K5Mutl以浓度依赖的方式抑制原代培养的视网膜内皮细胞，EC50(抑制50％细胞增生的药物浓度)约为35nmol／L，是完整K5活性的2倍。在同样浓度范围内，K5Mutl并不抑制同源的周皮细胞，表明K5Mutl特异性抑制血管内皮细胞增生。结论 K5Mutl是一种比K5作用更强的血管增生抑制因子，在糖尿病性视网膜病、年龄相关性黄斑变性和实体肿瘤等血管增生性疾病的治疗中具有潜在的应用价值。