Ⅱ型登革病毒E基因的克隆及其酵母表达

目的克隆2型登革病毒E基因并用酵母真核表达，获得全长的重组E蛋白，为其结构与功能的研究提供条件。方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6／36细胞上清中提取RNA，通过RT—PCR扩增E基因片段，与载体pPICZaB连接筛选得到重组质粒，电穿孔法将重组体整合入酵母菌P．pastoris，经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定，取Mut^ 菌诱导表达，SDS—PAGE、免疫印迹检测表达产物。结果RT—PCR得到1．5kb的E基因片段，酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长E基因；Mut^ 酵母转化菌可分泌表达约69kDa的蛋白，与DEN2E单抗的免疫印迹证实它为型特异的重组E蛋白。结论成功将克隆的全长。DEN2E基因在酵母菌中表达，获得的重组E蛋白具有免疫反应性。     

登革病毒非结构蛋白NS1群特异性单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备登革病毒NS1群特异性单克隆抗体,建立可检测登革病毒1～4型NS1抗原的ELISA检测法,为登革热的早期快速诊断奠定基础。方法应用毕赤酵母表达系统分泌表达登革病毒2型重组非结构蛋白NS1,以此为抗原免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选和亚克隆,获得能稳定分泌登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用所获得的单克隆抗体建立可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结果从登革病毒2型NS1重组毕赤酵母（Pichia Pastoris-NS1）中获得了大量纯化的登革病毒重组NS1蛋白;经免疫小鼠、细胞融合、间接ELISA筛选及3次亚克隆后,最终获得2株能高效分泌抗登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D7B6B4和2D10E2F6,间接ELISA显示抗体效价高达1∶8000～1∶16000;ELISA及免疫荧光检测证实,其所分泌的抗体与1～4型登革病毒及其重组NS1蛋白均有特异性免疫反应,为登革病毒NS1群特异性单克隆抗体;两株单克隆抗体均为IgG2a亚类;初步建立了检测4个血清型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结论成功研制出两株能高效分泌抗登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。初步建立了可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测法。     

登革2型病毒包膜蛋白在毕赤酵母中的表达和病毒样颗粒的组装

目的在组成型的毕赤酵母系统中表达登革2型病毒包膜蛋白E和前膜蛋白prM,并研究病毒样颗粒在酵母细胞中的组装特性。方法以登革2型病毒ZS01/01株mRNA为模板,扩增编码prM/E蛋白的基因。将目的基因克隆至表达载体pGAPZaA的多克隆位点,并转化毕赤酵母GS115。经Zeocin抗生素筛选和PCR鉴定后获得酵母菌重组克隆,并进行表达和鉴定。结果成功克隆登革2型病毒prM/E基因,SDS-PAGE和Western blot检测表明包膜蛋白E在组成型的毕赤酵母系统中得到高水平表达;利用透射电镜在重组酵母胞浆内检测到30-50 nm的登革2型的病毒样颗粒,并发现类似登革病毒感染的双层膜结构;免疫电镜结果证实重组病毒样颗粒可以与抗登革2型病毒血清反应,具有免疫反应性。结论成功的建立了组成型表达登革2型病毒样颗粒的毕赤酵母系统,为登革病毒样颗粒疫苗的制备奠定了基础。     

登革2型病毒NGC株E基因扩增和部分序列分析

目的 体外扩增、克隆登革2型病毒（NGC株）包膜糖蛋白E基因约1．5kb的基因片段,并对目的基因片段进行部分碱基序列测定和分析。方法 采用逆转录聚合酶链反应扩增出E目的基因片段,经限制性内切酶Kpn1/Xbal酶切后用低熔点琼脂糖挖块回收法回收纯化,插入真核表达载体pcDNA3的多克隆位点,构建重组体pcDNA3-E,转化大肠杆菌DH5a,通过对目的基因片段的部分碱基序列测定鉴定克隆的正确性,并分析其氨基酸变异。结果 从登革2型病毒（NGC株）中扩增出约1．5kb的DNA片段,目的基因片段的部分测序与参考序列的同源性为96．53％,7个氨基酸发生变异,4个变异氨基酸与登革2型病毒Jamaica株相应位置的氨基酸相同。结论 体外成功扩增并克隆DV2（NGC株）全长E基因片段,其序列变异及与其他毒株的同源性研究为登革病毒致病机理和疫苗的研究提供材料。     

霍乱弧菌O1群和O139群NhaA基因的克隆和变异性研究

霍乱弧菌是一种嗜盐性细菌 ,可在较宽盐浓度和ｐＨ值范围内生长 ,Ｎａ /Ｈ 离子交换泵与此密切相关。ＮｈａＡ基因所编码的ＮｈａＡ蛋白是维持该离子交换泵必需的功能蛋白。ＮｈａＡ基因的变异可使霍乱弧菌适应不同的外环境而得以生存。为了解我国霍乱弧菌Ｏ1群和Ｏ1 3 9群ＮｈａＡ基因的变异性与致病性的关系 ,我们采用ＰＣＲ和序列分析的方法 ,对来源于我国广东省和内地部分省份的 4 0株霍乱弧菌 (包括Ｏ1群和Ｏ1 3 9群 )ＮｈａＡ基因进行克隆和序列比较分析。根据霍乱弧菌Ｏ1群野毒株ＮｈａＡ基因序列 ,设计扩增引物序列为 :上游5′ ＣＣ…     

沙眼衣原体omp1基因VS1-VS2序列分析与基因分型

目的探讨沙眼衣原体ompl基因VS1-VS2序列基因分型和VS1-VS2基因突变率。方法巢式PCR扩增omp1基因的VS1-VS2序列，自动测序仪测序，运用DNAstar软件进行临床菌株与标准菌株序列的比对。结果99株临床标本分离株扩增出约453bp大小的VS1-VS2片段。与标准株比对，除3株测序出现双峰无法确定基因型外，96株菌株分为9个型，以F型29株（30．2％）、E型22株（22．9％）、J型19株（19．8％）、D型12株（12．5％）和H型8株（8．3％）为主。序列分析发现7株存在VS1区碱基的突变或插入，多为有义突变，突变率为7．3％，多见于D、E、F和H型。结论沙眼衣原体ompl基因序列分析在分子流行病学上具有一定意义。     

SARS冠状病毒膜蛋白膜内区的表达、纯化及抗原性初步研究

目的对SAILS冠状病毒膜蛋白膜内区基因片段进行克隆表达和表达产物的纯化复性,探讨该表达蛋白的抗原特性。方法克隆SAILS冠状病毒GD322株膜蛋白膜内区,在原核表达系统中表达His-融合蛋白,采用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析His-融合蛋白抗原特性。结果7份SARS临床诊断患者血清中5份血清能与His-融合蛋白反应,2份不与之反应。兔抗OCA3、229E血清及20份健康人血清皆不与His-融合蛋白反应。His-融合蛋白免疫动物可产生多克隆抗体。结论本研究获得的His-融合蛋白可与SARS临床诊断患者血清特异性结合,可免疫动物获得特异性多抗;但不与健康人血清及兔抗OCA3、229E血清发生特异性结合。     

SARS-CoV基因组及其产物的生物学功能(Ⅱ)

SARS-CoV具有多种蛋白酶,其中有3种蛋白酶(解旋酶和另外两种半胱氨酸蛋白酶)在病毒的复制、转录、翻译和/或翻译后加工等过程中发挥重要的生理和病理作用;而其结构蛋白则在形成病毒粒子、参与病毒的致病机制中发挥重要作用. 本文综述了SARS-CoV的主要产物酶及结构蛋白的结构及其功能等方面研究进展.     

登革病毒大片段NS3基因扩增的方法探讨

目的：探索一种快速、实用的扩增登革病毒大片段基因的方法。方法：用登革２ 型新几内亚 Ｃ 株（ Ｄ Ｖ２ , Ｎ Ｇ Ｃ 株）的核酸（ Ｒ Ｎ Ａ） 为模板,研究了在不同条件下（ 病毒和其变性液的量以及ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的浓度等） 通过逆转录聚合酶链式反应技术扩增大片段 Ｎ Ｓ３ 基因,并对扩增的目的基因用巢式 Ｐ Ｃ Ｒ 进行了鉴定。结果：用大量的或小量的登革病毒培养上清中提取 Ｒ Ｎ Ａ 的方法在一定条件下均可扩增出大片段 Ｎ Ｓ３ 基因。结论：小量登革病毒提取 Ｒ Ｎ Ａ 扩增大片段 Ｎ Ｓ３ 基因法较大量登革病毒提取 Ｒ Ｎ Ａ 扩增大片段 Ｎ Ｓ３ 基因快速、实用。     

登革病毒对人血管内皮细胞产生细胞因子的影响

目的了解登革病毒感染对人血管内皮细胞产生几种细胞因子的影响。方法用登革病毒Ⅱ型（ＤＶ－２）及ＬＰＳ单独作用或联合作用于人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ），于作用后４，２４，４８，７２和９６小时分别收集培养上清液，用ＥＬＩＳＡ法检测ＧＭ－ＣＳＦ，ＩＬ－６和ＴＮＦα的含量。实验数据采用方差分析处理。结果ＤＶ－２感染能使ＨＵＶＥＣ分泌ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－６的能力增强。病毒感染后４小时，ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－６的水平开始升高，并分别于感染后７２和２４小时达高峰，然后开始下降。然而，ＤＶ－２感染并不能提高ＨＵＶＥＣ分泌ＴＮＦα的能力。ＬＰＳ单独作用或ＤＶ－２与ＬＰＳ联合作用均可提高ＨＵＶＥＣ分泌ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－６的能力，但对分泌ＴＮＦα的能力没有明显的促进作用。结论登革病毒感染能提高ＨＵＶＥＣ分泌ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－６的能力。细胞因子在登革病毒的致病与免疫过程中可能起重要作用。