真核表达质粒pBK-Fas的构建及转染舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑瘤效应

目的 研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础.方法 采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV内,构建出重组真核表达质粒pBK-Fas,酶切鉴定并测序.脂质体法将pBK-Fas转染入Tca8113细胞,RT-PCR检测Fas mRNA表达及半定量分析,琼脂糖凝胶电泳检测Fas转染细胞凋亡,流式细胞仪检测Fas蛋白表达.通过细胞生长曲线描记和软琼脂集落形成实验研究Fas基因的体外抑瘤效应.结果 PCR扩增后的产物在约1 008 bp处出现明显的特异性条带,重组质粒pBK-Fas经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的Fas基因片段.经检测Fas基因转染能提高Fas mRNA 表达水平、Fas 蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数.Fas基因转染能提高Fas蛋白的表达强度,由转染前的34.01±4.76上升到转染后的55.72±7.33,差异有统计学意义(P<0.01).Fas转染细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径.MTT法检测细胞增殖抑制率的结果显示PBK-Fas转染组 Tca8113细胞的增殖抑制作用最明显,表明Fas基因转染能增加舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制率,结果与细胞生长曲线测定(计数法)结果具有一致性.软琼脂集落形成实验结果显示,与未转染细胞相比,重组质粒转染的Tca8113细胞群体倍增时间延长,克隆形成能力降低.结论 Fas基因片段被成功插入真核表达载体pBK-Fas质粒的多克隆位点.Fas基因转染能有效的抑制体外培养的舌鳞癌Tca8113细胞的生长.     

EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响

目的:了解EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:构建pSG5/BARF1真核表达载体,转染到EB病毒阴性的胃癌细胞系SGC7901,经RT-PCR鉴定,获得BARF1稳定表达的细胞克隆.以pSG5空载体转染细胞为对照,进行细胞凋亡诱导实验、细胞增殖实验、软琼脂集落形成实验和细胞迁移实验.结果:与对照组相比,BARF1表达细胞组经抗癌药顺铂诱导后的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),增殖速度显著加快(P<0.01),软琼脂集落形成率显著提高(P<0.05),细胞迁移能力显著增强(P<0.05).结论:BARF1基因能够全面增强胃癌细胞的肿瘤原性,可能在EB病毒相关胃癌发生与演化的整个过程中起重要作用.     

Epstein-Barr病毒LMP1-exonl反义表达载体对NPC细胞生长的抑制作用

目的　研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法　用反义LMP1DNA的真核表达载体anti—pcDNA3．1—LMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2，G418筛选抗性克隆;Western-blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达；用MTT法、细胞生长曲线和软琼脂集落形成能力实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果建立反义CNE2细胞克隆；转染后LMP1蛋白表达降低；转染后细胞活力和生长速度均有下降，集落形成能力显降低。结论　将反义LMP1真核表达载体导入细胞能成功抑制NPC细胞的生长，逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。     

Netrin-1促进肝癌细胞HepG2抗失巢凋亡的作用

目的 初步探讨神经生长因子Netrin-1对人肝癌细胞HepG2抗失巢凋亡的作用及相关机制.方法 采用脂质体转染的方法,将Netrin-1的真核表达质粒转染到肝癌细胞HepG2中,Western blot检测Netrin-1的表达;用软琼脂集落试验、悬浮培养模型及流式细胞检测的方法观察肝癌细胞HepG2抗失巢凋亡的特性.结果 肝癌细胞HepG2在失巢状态下可以聚集成团生长,并与贴壁生长有相似的凋亡比例.与对照组细胞相比,稳定转染Netrin-1真核质粒的HepG2细胞在软琼脂中形成细胞集落的数量明显增加,在悬浮培养模型中形成细胞团的直径更大,在失粘附状态下的细胞凋亡比例明显降低;磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的抑制剂LY294002能增加转染细胞在失粘附状态下的凋亡比例.结论 肝癌细胞HepG2具有抗失巢凋亡的特性,Netrin-1可以增强HepG2细胞抗失巢凋亡的能力,其机制可能与PI3-K通路相关.     

5-烯丙基-7-二氟甲基白杨素诱导肺癌A549细胞生长抑制和凋亡

目的:研究5-烯丙基-7-二氟甲基白杨素(ADFMChR)诱导人肺癌细胞(A549)细胞生长抑制和凋亡的作用。方法:体外培养人肺癌A549细胞,平皿集落形成法测定细胞锚定依赖性生长能力,软琼脂集落形成法测定细胞非锚定依赖性生长能力,流式细胞术(FCM)分析细胞周期和细胞凋亡率;凝胶电泳观察凋亡细胞的基因DNA梯形条带。结果:平皿集落形成法和软琼脂集落形成法结果显示ADFMChR呈剂量依赖性抑制A549细胞生长,FCM分析发现ADFMChR呈剂量依赖性诱导A549细胞凋亡;ADFMChR(10μg/mL)孵育A549细胞48h后,DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型梯形条带。结论:ADFMChR具有抑制人肺癌A549细胞生长和诱导凋亡作用。     

外源性mIκBα基因抑制肝癌细胞HepG2的生长

目的观察核转录因子的抑制基因mIκBα在肝癌细胞株HepG2的表达及对该细胞株生长的影响。方法将由293包装细胞产生的含mIκBα的Ad腺病毒上清(Ad-mIκBα)和含包装载体的腺病毒上清(Adv)感染HepG2细胞,观察感染后HepG2细胞的绿色荧光蛋白(GFP)表达和mIκBα蛋白表达,并观察细胞的平板集落形成数、软琼脂集落形成能力、细胞生长曲线、裸鼠成瘤实验。结果肝癌细胞感染腺病毒后GFP表达阳性,感染含mIκBαAd腺病毒的肝癌细胞有mIκBα蛋白表达;HepG2/Ad-mIκBα细胞形成的集落数明显比HepG2/Adv和HepG2细胞形成的集落数少(P<0.05);HepG2细胞、HepG2/Adv细胞在软琼脂内存活,并形成桑椹样细胞集落,而HepG2/Ad-mIκBα细胞在软琼脂上无生长;细胞生长曲线显示HepG2/Ad-mIκBα细胞生长速度较HepG2/Adv、HepG2亲本细胞有所减慢,但饱和密度无显著性差异。裸鼠接种4周后HepG2/Ad-mIκBα细胞成瘤率为80%,HepG2/Adv细胞成瘤率为100%,肿瘤形成率无显著性差异,HepG2/Ad-mIκBα细胞形成的肿瘤的体积比HepG2/Adv细胞形成的肿瘤的体积明显减小(P<0.05)。结论mIκBα基因可以抑制HepG2肝癌细胞的生长。     

EGCG抑制HL-60细胞增殖作用的机制研究

目的探讨EGCG抑制白血病HL-60细胞增殖的作用机制。方法采用软琼脂集落形成实验和绘制细胞生长曲线,检测EGCG对HL-60细胞增殖的影响;FCM及DNA凝胶电泳法检测EGCG处理HL-60细胞后的凋亡情况;实时荧光定量RT-PCR和Wester blotting检测AKT1的表达。结果细胞生长曲线和软琼脂集落形成实验结果均显示EGCG呈浓度依赖性抑制HL-60细胞的增殖（P〈0.05）;FCM及DNA凝胶电泳法结果显示EGCG呈浓度依赖性诱导HL-60细胞的凋亡（P〈0.05）。实时荧光定量RT-PCR和Wester blotting结果显示EGCG浓度升高,HL-60细胞中AKT1的表达降低。结论 EGCG可能通过下调AKT1的表达,促进细胞凋亡,发挥其对HL-60细胞增殖的抑制作用。     

siRNA联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达的影响。方法 在肺癌A549细胞中转染survivin基因的siRNA,分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blotting方法检测survivin基因mRNA和蛋白的表达。将肺癌A549细胞分为单纯放射组、单纯转染组、转染+放射组,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用细胞集落形成实验检测细胞增殖情况,采用CCK8测细胞生长曲线。结果 siRNA能抑制肺癌细胞survivin基因mRNA和蛋白的表达。siRNA联合预照射较单纯转染和单纯放射能显著增加细胞凋亡率,降低细胞的集落形成,抑制细胞生长。结论 预照射可以增强siRNA对肺癌细胞survivin基因的抑制作用。     

人胃癌细胞株抗脱落凋亡特性的分析

目的：研究胃癌细胞HGC27，BGC823，MGC803，SGC7901抗脱落凋亡的特性，为研究肿瘤细胞抗脱落凋亡的机制奠定基础。方法：应用软琼脂集落形成实验，DNA ladder检测，流式细胞术等技术观察胃癌细胞脱落培养后细胞生长状况的改变。结果：对照组细胞MDCK（狗的正常肾脏上皮细胞系）在软琼脂中不生长，没有形成细胞集落；悬浮培养15h后，可见有细胞凋亡特征性的DNA ladder出现；流式细胞仪检测，悬浮培养24，48h可见有凋亡峰出现，而HGC27等4种胃癌细胞系在软琼脂中均形成大小不等的细胞集落，脱落培养15h后，没有细胞凋亡特征性的DNA ladder出现，流式细胞仪检测，与贴壁培养的对照组相比细胞周期没有显性差异。也没有凋亡峰的出现。结论：MDCK细胞属于锚着依赖性细胞，可出现脱落凋亡，胃癌细胞HGC27，BGC823，MGC803，SGC7901属于抗脱落凋亡细胞。     

ElA抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖及其分子机制

目的:本研究将ElA基因转染HER-2表达阳性的乳腺癌细胞系MCF-7,并研究ElA对MCF-7细胞增殖的抑制作用及其分子机制.方法:利用基因转染技术检测MCF-7细胞中ElA的表达,RT-PCR和Western杂交检测ElA基因对HER-2 mRNA和蛋白表达水平的调控,MTT法检测ElA对MCF-7细胞增殖的押制作用,软琼脂集落法检测ElA对MCF-7细胞集落形成的影响,并利用流式细胞术检测ElA对MCF-7细胞凋亡的调控.结果:MCF-7细胞无内源性的ElA表达,ElA在MCF-7细胞内的表达显著性地降低了细胞中HER-2 mRNA和蛋白表达水平,诱导MCF-7细胞发生凋亡.细胞增殖曲线显示ElA基因显著性抑制MCF-7细胞增殖和细胞集落形成能力.结论:ElA基因能降低人乳腺癌细胞MCF-7的HER-2表达,诱导细胞发生凋亡,从而抑制细胞的增殖和细胞集落形成能力.     

生存素反义寡核苷酸诱导膀胱癌细胞凋亡及增强其化疗敏感性

目的探讨生存素反义寡核苷酸（生存素-ASODN）对化疗药多西紫杉醇（泰索帝）诱导膀胱癌细胞系BIU87细胞凋亡的影响。方法将已构建成功的生存素-ASODN真核表达载体pcDNA3-SWas通过脂质体介导转染膀胱癌细胞系BIU87,并筛选转染成功的阳性克隆;采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测其生存素mRNA表达;锥虫蓝拒染法观察生存素-ASODN与泰索帝联合应用对BIU87细胞生存的影响;细胞计数和四甲基偶氮唑盐（MTT）试验测定转染细胞对泰索帝敏感性;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡DNA断裂情况;核染色检测凋亡细胞的细胞核的变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果转染生存素-ASODN真核表达载体pcDNA3-SWas的BIU87-SVVas细胞生存素mRNA表达水平下降、细胞增殖明显受抑,与转染pcDNA3空载体BIU87-neo细胞、未转染载体的BIU87细胞进行比较,差异均有统计学意义（均P〈0．05）;经琼脂糖凝胶电泳,BIU87-SVVa8细胞可见到DNA梯形条带,而其他对照组未见到;与BIU87-neo、BIU87细胞相比,BIU87-SVVas细胞的细胞核呈致密浓染;加入泰索帝的BIU87-SVVas细胞组的凋亡率大幅度增加。结论生存素-ASODN可促进泰索帝诱导BIUg7细胞凋亡及增加其对泰索帝的敏感性,为膀胱癌的生物学治疗研究奠定了实验基础。     

格列卫与六亚甲基二乙酰胺对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究格列卫和六亚甲基二乙酰胺(HMBA)对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期及周期蛋白表达的影响．方法：MTT法观察细胞生长指数和细胞存活率，流式细胞仪、电镜检测细胞周期和凋亡，半定量RT-PCR检测bcr-abl基因的表达，Western blotting检测蛋白表达．结果：联合应用两种药物后细胞存活率明显下降，凋亡比例略下降，细胞周期阻滞于G0／G1期，cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK4、c-myc蛋白表达下调．结论：两种药物应用后出现细胞存活率下降、细胞周期阻滞、周期蛋白表达下调、凋亡比例下降，联合作用对细胞的增殖抑制具有协同作用，进入凋亡途径细胞减少。     

RNAi抑制胰腺癌细胞survivin表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的构建RNAi表达载体，并分析其对胰腺癌细胞PANC-1 survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达，并把survivin基因克隆到T载体进行测序，构建针对survivin基因的干扰载体，用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1，RT-PCR、western-blot分析干扰载体对survivin表达的抑制情况，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达，其基因序列与GenBank中公布的一致，干扰载体pTZU6＋1-svv2可以有效的抑制survivin的表达，抑制率约为74％，并诱导了肿瘤细胞的凋亡。结论用RNAi表达载体可以有效抑制胰腺癌细胞PANC-1中凋亡抑制蛋白survivin的表达并诱导胰腺癌细胞凋亡。     

转染VEGF-ASODN对胃癌细胞Survivin表达的影响

目的了解转染VEGF—ASODN（血管内皮生长因子反义寡核苷酸）对胃癌细胞Survivin（生存素）表达、细胞生长的作用．方法人工合成硫代磷酸化VEGF-ASODN,转染胃癌细胞SGC-7901,用Western-blot法检测细胞Survivin蛋白表达量、用流式细胞仪检测转染后细胞凋亡情况、用MTT检测转染后细胞生存力、细胞生长曲线检测转染后细胞生长情况．结果转染VEGF-ASODN能降低细胞Survivin蛋白,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）,转染后细胞凋亡与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）,能降低细胞的生存力及抑制细胞生长．结论VEGF-ASODN能抑制Survivin蛋白表达、抑制胃癌细胞生长、增加胃癌细胞的凋亡．     

慢病毒载体介导siRNA对人喉癌抑瘤作用的实验研究

目的研究慢病毒载体介导siRNA抑制survivin基因表达后对人喉癌hep-2细胞体内增殖能力的影响以及对裸鼠移植人喉癌的抑瘤活性。方法应用裸鼠成瘤实验测定致瘤能力的改变,采用RT-PCR和Western blotting测定干扰后survivin基因及其蛋白的表达水平;流式细胞术检测喉癌细胞凋亡指数和增殖指数。结果靶向survivin基因的siRNA可以有效抑制survivin基因的表达,使survivin-mRNA表达减少60%-85%,蛋白表达减少70%;流式细胞术检测细胞凋亡率明显提高(P<0.01),降低了在裸鼠体内成瘤的能力。结论RNA干扰survivin基因表达后明显抑制了人喉癌hep-2细胞的体内增殖能力;siRNA介导的survivin基因下调可明显抑制肿瘤细胞在体内的生长。     

RNA干涉下调survivin基因对人肝癌细胞的生长抑制及促凋亡作用

目的：探讨RNA干涉技术下调survivin基因表达对人肝癌细胞的生长抑制及促凋亡的作用,为肝癌的基因治疗提供有效靶点及技术。 方法：构建pSU6-si-survivin重组质粒,转染人肝癌细胞株Bel7402,设空白组、阴性组和治疗组,采用MTT法检测肝癌细胞的增殖活性,RT-PCR检测survivin基因mRNA水平,Western blotting及免疫组化法检测survivin蛋白表达,流式细胞技术(FCM)及AO/EB染色观察细胞凋亡。结果：MTT法检测,治疗组24、48〖JP3〗和72　h细胞生长抑制率(%)分别为21.43±1.67、39.07±3.80和59.72±〖JP〗7.05,与阴性组比较差异有显著性 (P<0.01）。RT-PCR及Western blotting检测,治疗组细胞survivin基因在mRNA及蛋白水平上表达均下降,上述产物量与β-actin的比值与空白组和阴性组比较差异均有显著性（P<0.01）。FCM检测治疗组细胞阻滞于G₀/G₁期,凋亡率为（20.65±1.28）%,与空白组及阴性组比较差异有显著性(P<0.01)。AO/EB双染色治疗组细胞呈早中期凋亡。结论：重组质粒pSU6-si-survivin可抑制survivin基因在人肝癌细胞中的表达,抑制肝癌细胞生长,促进肝癌细胞凋亡;survivin基因可作为肝癌基因治疗的重要靶点。     

表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。     

人DNA MTase反义基因转染对诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响

目的；观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721凋亡的影响。方法：采用脂质体法将构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；采用MTT法绘制生长曲线；流式细胞法和原位末端标记法检测细胞凋亡改变。结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂质体法成功将重组载体转染入细胞；生长曲线显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞增殖速度减慢；流式细胞法测得其凋亡率由3．1％增加到13．5％，末端标记法也显示其调亡指数增加。结论：人DNA MTase反义基因转染可诱导肝癌细胞系SMMC－7721凋亡。凋亡基因功能被恢复可能主要原因之一。