酪氨酸激酶抑制剂STI571与P21WAF基因克隆治疗慢性粒细胞白血病的实验研究

本研究探讨酪氨酸激酶抑制剂ST1571和P21^WAF基因克隆对慢性粒细胞白血病急变K562细胞株的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的治疗作用。RT—PCR扩增P21^WAF基因，胶纯化回收后连接到T载体测序，序列正确后构建P21—pcDNA3．1栽体，将P21—pcDNA3．1与空载体分别以脂质体转染入P21蛋白表达缺如的K562细胞，经筛选得到G418抗性的K562细胞株，Westernblot证实转染后有P21蛋白表达，MTT法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果表明：表达外源性P21蛋白的P21—pcDNA3．1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株，流式细胞仪显示G0／G1期细胞增多，MTT法显示P21—pcDNA3．1-K562细胞与ST1571联合应用后，与单用ST1571作用的K562细胞相比，凋亡细胞比例轻度减少，细胞存活率下降较慢。结论：表达外源P21蛋白能抑制K562细胞增殖，同时对ST1571的促凋亡作用有轻度抑制，并降低K562细胞对ST1571的敏感性。     

bcl-2反义寡聚脱氧核苷酸抑制HL-60细胞生长的研究

在体外培养中研究了基因的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleo-tide,ASON)对HL-60细胞生长增殖的影响。根据bcl-2基因cDNA的序列分析,以bcl-2mRNA翻译起始区域前15个核苷酸为作用靶序列,人工合成了15聚ASON片段,同时合成15聚无关寡聚核苷酸(ODN)片段,以作序列特异性对照。把上述ASON和无关ODN片段与HL-60细胞共培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学和~3H-TdR掺入率。实验发现:从3.5—30.0μmol/L的ASON对细胞生长有不同程度抑制作用,低于10μmol/L时抑制作用小,大于10.0μmol/L时抑制作用显著,浓度愈大,抑制程度愈大,而无关ODN作用组的细胞生长状态与空白对照组无显著差别,作用48小时后浓度3.5μmol/L抑制率为6％,而20.0μmol/L时上升为40％;作用96小时后3.5μmol/L的ASON抑制率是5.1％,30μmol/L的抑制率高达67％。相同浓度的ASON作用不同时间后,细胞生长率各不相同,当浓度达到14.0μmol/L时,48小时的细胞生长抑制率达22％,72和96小时的抑制率分别为25％和29.3％。HL-60细胞被ASON处理后,培养体系中死细胞数随时间延长而增加,浓度在10—30μmol/L范围内,死细胞率由2％增到50％,但在无关ODN及空白对照组中未观察到这种现象。同时发现由于bcl-2的ASON作用使HL-60细胞的     

酪氨酸激酶抑制剂STI571治疗慢性粒细胞白血病的研究

目的:研究特异性酪氨酸激酶抑制剂STI571对慢性粒细胞白血病(简称慢粒)细胞增殖、凋亡、周期调控及bcr-abl融合基因表达的影响,为慢粒的基因治疗提供理论依据。方法:细胞培养慢粒急变细胞系K562细胞株,通过MTT检测STI571作用下细胞存活率,流式细胞仪检测周期变化,电镜及DNA电泳检测细胞凋亡,半定量RT-PCR检测STI571对bcr-abl融合基因表达的影响。结果:STI571作用后K562细胞中G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少。流式细胞图中的二倍体峰前可见一明显亚二倍体峰———凋亡峰(apoptosispeak),提示STI571能明显诱导K562细胞凋亡。电镜发现STI571作用于K562细胞12～72h后,诱导出各期凋亡细胞及凋亡小体。半定量PCR灰度扫描结果显示bcr-abl基因的mRNA表达下降,电泳检测扩增产物,荧光亮度减弱。结论:STI571能明显抑制白血病细胞增殖,细胞阻滞于G0/G1期,且具有明显的诱导凋亡作用,反馈抑制bcr-abl融合基因的表达。     

伊马替尼联合P27基因克隆对慢性粒细胞白血病K562细胞的作用

目的:探讨伊马替尼和P27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。方法:RT-PCR扩增P27基因,胶纯化回收后连接到T载体测序,序列正确后构建P27-pcDNA3.1载体,将P27-pcDNA3.1与空载体分别以脂质体转染入P27基因缺失的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株,Westernblot证实转染后有P27蛋白表达,MTT法检测细胞生长指数和细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果:表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株,流式细胞仪显示G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少,P27-pcDNA3.1-K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升,MTT法显示细胞存活率较P27-K562细胞组及伊马替尼-K562细胞组均明显下降(P<0.01vsP27-K562细胞组,P<0.05vs伊马替尼-K562细胞组)。结论:表达外源P27蛋白联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

辅助性T细胞亚群趋化性细胞因子受体的表达及其临床意义

趋化因子与趋化因子受体的结合可介导免疫细胞向相应组织部位趋化，保证免疫应答反应的特异性和区域性，因而，研究不同细胞群和亚群趋化因子及受体的表达对于阐明免疫应答的调节有重要作用，也有助于寻找新的药物靶点以指导免疫调节治疗。     

Th1／Th2细胞失衡对重型再生障碍笥贫血CD34^＋细胞的免疫抑制效应

再生障碍性贫血 (再障 )的发病与Ｔ细胞介导的造血抑制有密切联系[1,2 ] 。我们曾发现 ,重型再障患者骨髓的Ｔｈ1样细胞因子干扰素 (ＩＦＮ)γ水平明显上调 ,而Ｔｈ2样因子ＩＬ 4却大致正常 ,间接提示重型再障可能存在Ｔｈ1/Ｔｈ2细胞比例失衡[3] 。为探讨Ｔｈ1/Ｔｈ2细胞失衡对骨髓造血功能的效应 ,我们利用ＣＤ34 细胞和Ｔｈ细胞的混合培养体系 ,在体外模拟Ｔｈ1/Ｔｈ2细胞的交互调节过程 ,观察了对ＣＤ34 细胞扩增和集落形成的影响。一、对象与方法1.对象 :初诊的 1例重型再障男性患者 ,以抗胸腺细胞球蛋白 环孢霉素Ａ治疗 5个月后达完…     

重型再生障碍性贫血患者骨髓T细胞克隆的初步研究

目的建立源于重型再生障碍性贫血(重型再障)患者骨髓的T淋巴细胞克隆,以便研究该病的发病机理.方法用免疫分选法分别从1名初诊重型再障患者及对照的骨髓中富集CD34+和CD3+细胞.将CD3+细胞作反应细胞、照射过CD34+细胞作刺激细胞,进行14d单向自身混合淋巴细胞培养.对活细胞作有限稀释和单个细胞分孔接种,与含IL-2和PHA-P的饲养细胞体系共培养.观察挑选细胞生长孔,计算接种率,用泊松(Poisson)分布初步判断单个细胞分离过程成功与否.而后将阳性孔细胞作转孔培养,定期用饲养抚育刺激、常规用IL-2支持增殖以扩大各克隆的数量.用SABC-P免疫细胞化学染色法,初步鉴定各克隆CD4/CD8抗原表型.结果自身混合淋巴细胞培养后的活细胞数,病例为4×103,对照为65.单细胞分离接种培养后,对照组的细胞生长孔数为0;而病例组的培养板上,共有11孔发生细胞增殖,相应的实际接种率是2.1%,未超出Poisson理论接种率值范围(＜26%),判明平均每个增生孔的细胞克隆前体数不大于1.这11个克隆中,9个呈CD4单阳性表型,阳性为98%;2个为CD8单阳性表型,阳性率为98%.结论从1例重型再障患者骨髓中分离出了11株T淋巴细胞克隆.进一步鉴定分析这些克隆的表型和特异性,以及探讨其Th1(Tc1)/(Th2)(Tc2)效应类型等功能表现,对研究重型再障的免疫学机理具有积极的意义.     

实验诊断学第二课堂的开设与探讨

通过第二课堂活动使教学与临床紧密结合,弥补课堂教学中的不足.以参观及急诊见习作为临床第二课堂,扩大学员眼界,激发学习热情;制作与教学内容密切相关的全英文注释挂图,让学员自学、自讲,作为英语第二课堂,培养提高学员的英文自学、表达及交流等综合素质.民意测验表明,第二课堂活动深受学员欢迎,值得推广应用.     

实验诊断学第二课堂的开设与探讨

通过第二课堂活动使教学与临床紧密结合，弥补课堂教学中的不足。以参观及急诊见习作为临床第二课堂，扩大学员眼界，激发学习热情；制作与教学内容密切相关的全英文注释挂图，让学员自学、自讲，作为英语第二课堂，培养提高学员的英文自学、表达及交流等综合素质。民意测验表明，第二课堂活动深受学员欢迎，值得推广应用。