新型阳离子基因传递载体聚乙烯亚胺-醋酸酐的细胞转染研究

 目的 研究非病毒基因载体聚乙烯亚胺（PEI）-醋酸酐（ACA）共聚物的组成对体外介导基因传递的影响，评价其作为基因载体的可行性。方法 通过粒径分析观察PEI-ACA与质粒DNA自组装形成的颗粒形态及粒径，预测其进入细胞的可能性。以MTT法检测PEI-ACA和PEI的细胞毒性。以PEI-ACA、PEI为载体，在不同的N/P比值的条件下，将绿色荧光蛋白基因pEGFP-C3导入真核细胞株A549细胞，以荧光显微镜及荧光分光光度计系统检测其转染效率。结果 PEI-ACA转染效率高于PEI，同时PEI-ACA的细胞毒性显著低于PEI。结论 新型阳离子多聚物PEI-ACA提高PEI介导的基因转染效率同时降低其细胞毒性，有望成为基因转染的有效载体。     

新型纳米材料HPC-g-PDMAEMA作为基因载体的研究

 目的 研究新型纳米载体HPC-g-PDMAEMA（HPD）对于不同肿瘤细胞系的转染能力，评价其在基因治疗及研究中的作用，并且初步探索HPD对于siRNA的运载能力。 方法 HPD和脂质体2000（Lipo 2K）运载绿色荧光蛋白（GFP）质粒，分别转染MCF7、973、JF305 3种肿瘤细胞系，采用流式细胞仪检测其转染效率；HPD和Lipo 2K运载针对GADPH的siRNA，转染MCF7，利用RT-PCR检测其RNA转染效率。结果 对于MCF7细胞，HPD的DNA转染效率高于Lipo 2K；对于973细胞，二者转染效率相近；对于JF305细胞，HPD转染效率低于Lipo 2K。在MCF7细胞中，利用HPD进行RNA转染，效率低于Lipo 2K。 结论 对于不同的肿瘤细胞系，可以采用不同的基因载体进行转染，从而提高转染效率。     

RPS20 miRNA质粒载体的CT26细胞转染条件优化研究

目的探讨阳离子脂质体法转染CT26细胞适宜的转染条件,为小鼠体内以RNA干扰法进行脾虚证相关基因RPS20的功能鉴定提供参考。方法以6孔培养板培养CT26细胞,利用阳离子脂质体转染pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-neg Control plasmid进入CT26细胞,荧光显微镜、流式细胞仪两种方式观察不同剂量的质粒和转染试剂对转染效率的影响。结果荧光显微镜下细胞计数法检测转染效率,4.0μg和6.0μg质粒的转染效率无明显差异;流式细胞仪检测转染效率,以Lipofectamine2000 15.0μL+质粒4μg转染效率最高,平均为25.3%。结论 6孔培养板,4.0μg质粒+15.0 μL Lipofectamine2000为CT26细胞优化的转染条件。     

脂质组分对阳离子脂质体介导的基因转染的影响

 目的研究阳离子脂质体膜的组分对细胞摄取和基因转染的影响。方法以十八酰胺(SA)、3β[N-(N′,N′-二甲基氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇(DC-Chol)、卵磷脂(SPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等为膜材,制备阳离子脂质体。用流式细胞仪测定不同阳离子脂质体对细胞摄取荧光标记寡核苷酸(FAM-ODN)的效率,结合荧光显微镜观察报告基因(pEGFP-N1)编码的绿荧光蛋白(GFP)表达的情况。结果不同阳离子脂质对细胞摄取产生截然不同的效果,DC-Chol/SPC脂质体对细胞摄取ODN的促进作用显著高于SA/SPC脂质体;而中性脂质对基因表达有重要影响,DC-Chol/DOPE脂质体的转染效率优于DC-Chol/SPC脂质体。结论通过药剂学的处方筛选,可以提高阳离子脂质体作为非病毒载体的性能。     

聚乙烯亚胺-乳酸羟基乙酸共聚物阳离子纳米粒介导宫颈癌细胞基因转染效率的研究

 目的优化聚乙烯亚胺-乳酸羟基乙酸共聚物(PEI-PLGA)阳离子纳米粒介导的癌细胞基因转染效率。方法用二步法制备报告基因质粒pCMVβ/PEI-PLA纳米粒复合物,透射电镜观察粒子形态,Zeta粒度仪测定粒径和表面电荷。以pCMVβ基因质粒与纳米粒的比(N/P)、转染时间和基因转染剂量为条件,转染效率为指标,正交设计法优化pCMVβ/PEI-PLGA纳米粒复合物的转染效率。结果pCMVβ/PEI-PLGA纳米粒复合物呈单分散球形,N/P比为10∶1,Zeta电位为+16.5mV,平均粒径为217nm,基因质粒剂量为每孔3μg时,纳米粒复合物的转染效率最高为16.35%。结论PEI-PLGA纳米粒可有效将报告基因质粒转移入宫颈癌细胞,优化实验条件可提高转染效率。     

阳离子聚乙烯亚胺高分子聚合物对青霉素类抗生素的抑菌增效作用

 目的评价聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)多阳离子聚合体对青霉素类抗生素体外抑制铜绿假单胞菌(Pscudomonas aeruginosa,100609)活性的影响。方法采用光密度法测定PEI多阳离子聚合体分别与4种青霉素类抗生素联合使用对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度的影响。同时使用光密度法测定不同浓度相对分子质量为10000PEI多阳离子聚合体与亚最小抑菌浓度(11.5%MIC的浓度)的替卡西林共同作用对P.aeruginosa,100609的抑菌作用并计算抑菌百分数。结果相对分子质量为10000,260mg·L^-1的PEI分别使替卡西林,羧苄西林,氨苄西林和哌拉西林的MIC降低4～64倍。在细菌动力学致死-增殖研究中,发现PEI可显著增强替卡西林对P.aeruginosa,100609的抑菌作用,且其作用与PEI的浓度存在正相关性,表明PEI与青霉素类抗生素具有协同作用。结论PEI多阳离子聚合体可以显著增强青霉素类药物对P.aeruginosa,100609的抑菌活性。     

聚乙烯亚胺及其衍生物介导siRNA递送的研究进展

 目的 介绍非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI及其衍生物介导小干扰RNA（siRNA递送的研究现状,为开发新型载体开阔思路。方法 查阅国内外有关文献,总结、归纳已报道的递送siRNA的各种PEI载体及其相关研究。结果与结论 综述了单独PEI、各种PEI衍生物递送siRNA的研究进展。PEI等聚合物基因载体由于其设计灵活在核酸递送中显示了巨大的潜力,随着对PEI聚合物转染机制的进一步研究与结构的合理修饰,PEI及其衍生物将会在非病毒载体领域扮演更重要的角色。     

三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第二跨膜结构域缺失突变体的构建及其抗砷性研究

 目的 检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）蛋白第2跨膜结构域(the second transmembrane domain,TMD2)中关键的抗砷结构域。方法 采用重叠区扩增基因拼接法构建三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因TMD2的一系列缺失突变体,分别转染至HeLa细胞,激光共聚焦观察其定位,Cell Counting Kit-8检测48 h急性砷中毒后生存率的变化,原子荧光吸收光谱法检测细胞内的总砷含量。结果 激光共聚焦证实各突变体的编码蛋白均定位在HeLa细胞的细胞膜上。CCK-8结果显示,转染胞外第4、5环,胞内第4、5环缺失突变体的HeLa细胞IC₅₀分别为33.18、32.84、33.45、34.29 μmol·L^-1,与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒的HeLa细胞(IC₅₀为33.96 μmol·L^-1)无显著差异,均高于空载体转染对照组(IC₅₀为19.01 μmol·L^-1)。转染胞外第6环缺失突变体HeLa细胞的IC₅₀为19.95 μmol·L^-1,与空载体对照组无显著差异,显著低于野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒转染组。原子荧光分光光度法结果显示,转染胞外第6环缺失三磷酸腺苷结合盒转运体A1的HeLa细胞内砷含量与转染空载体接近,而转染其他突变体的结果与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1的结果基本一致。结论 成功构建了5个三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第2跨膜结构域的缺失突变体,且其表达的蛋白仍然正确定位于HeLa细胞的细胞膜上。突变体（除胞外第6环外）仍然具有一定的抗砷性,提示三磷酸腺苷结合盒转运体A1胞外第6环可能是关键抗砷结构域。     

阳离子固体脂质纳米粒/pDNA二元复合物的初步研究

 目的制备阳离子固体脂质纳米粒/pDNA二元复合物(SLNs-pDNA),并研究该复合物的药剂学和生物学特征。方法复乳法制备空白阳离子固体脂质纳米粒,与报告基因复合,加入不同浓度Ca²⁺调节体系的荷正电量,分别对纳米粒的相关理化性质,细胞毒性,体外释药特性及其保护pDNA抵抗核酸酶降解的能力进行考察,通过体外基因转染实验对复合物在COS-7细胞中的转染效率进行了初步评价。结果本实验中制备的纳米粒呈球形或类球形,平均粒径(51.9±0.58)nm,Zeta电位(47.4±1.1)mV,加入Ca²⁺显著提高了纳米粒复合pDNA的能力,制得的复合物平均粒径为(91.6±5.3)nm,Zeta电位为(31.5±1.4)mV。细胞毒性实验表明,纳米粒对COS-7细胞的毒性较小,凝胶阻滞分析表明,阳离子固体脂质纳米粒能够充分结合pDNA,形成稳定的复合物。pDNA保护性实验表明,该复合物对pDNA有很好的保护作用。体外释放实验结果表明,SLNs-pDNA具有缓释能力。体外基因转染实验表明,该复合物能够转染COS-7细胞,复合物所荷基因能够在该细胞中表达。结论阳离子固体脂质纳米粒/DNA复合物是一种制备工艺简单,复合物粒径较小,细胞毒性小,对pDNA保护作用强,所载DNA能够从复合物中缓慢释放,体外转染效率较高的具有一定开发前景的非病毒纳米基因载体。     

阳离子脂质体介导端粒酶反义寡核苷酸促进对HeLa细胞生长的抑制作用

 目的考察阳离子脂质体(CL)为载体的反义寡核苷酸(ASODN)序列对HeLa细胞的抑制作用。方法选择以人端粒酶模板RNA(hTR)和人逆转录酶催化亚基(hTERT)为靶点的两种ASODN,用3β[N-(N′,N′-二甲氨基乙基)氨甲酰基]-胆固醇(DC-Chol)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)制备CL,考察其形态和粒径分布,并用其介导反义寡核苷酸转染HeLa细胞,通过噻唑蓝比色法(MTT)研究对细胞的抑制作用。结果CL外观呈圆形,粒径均匀,在体外能够有效转染反义hTR和反义hTERT寡核苷酸序列(anti-hTR,anti-hTERT)。CL/ASODN处理后的HeLa细胞,72h后的存活率为(19.82±12.19)%(anti-hTR,2.0μmol·L^-1)和(16.59±4.10)%(anti-hTERT,2.0μmol·L^-1),而相同浓度游离的ASODN没有发现抑制作用。CL/ASODN复合物能够在120h内持续抑制HeLa细胞的生长。结论CL能够有效提高ASODN对HeLa细胞的抑制作用,作为端粒酶抑制剂的新型非病毒载体,具有良好的应用前景。     

仙慈丹有效部位对人肺癌细胞A549增殖的抑制作用

目的:探讨仙慈丹(XCD)有效部位对肺癌细胞A549增殖抑制作用及其作用机制.方法:XCD有效部位为XCD水提滤液通过AB-8型大孔树脂柱收集80％乙醇洗脱液所得,得率为0.90％.体外培养A549细胞至对数期,分别以质量浓度为5,10,15,25,50,100,200 mg·L-1的仙慈丹有效部位作用,应用MTT法测定其对A549细胞的抑制率,进而求出半数抑制浓度(IC50).运用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术及PI单染流式细胞术测定XCD有效部位对A549细胞凋亡及周期的影响.结果:通过MTT实验,经过统计计算得出XCD有效部位在对A549作用24,48,72 h后的IC50分别为136.550,56.671,55.322 mg·L-1;通过流式细胞仪测定XCD作用下A549在24,48,72 h的凋亡率分别为(17.98 ±0.11)％,(23.34 ±0.23)％,(29.54±0.78)％;XCD作用A549细胞24 h后,细胞周期被阻滞在S期,在48 h后细胞周期被阻滞在G0/G1期.结论:XCD有效部位对A549细胞增殖抑制作用明显,通过诱导肿瘤细胞凋亡,同时调节细胞周期抑制A549细胞生长.     

S型与R型人参皂苷Rh2对人肺腺癌A549 细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨人参皂苷Rh2(S型与R型)对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响,以阐述人参活性成分抗肿瘤活性的构效关系及可能机制.方法:采用MTT实验测定细胞增殖;碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数,观察人参皂苷Rh2对人肺腺癌A549细胞增殖周期的影响.AnnexinV-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,采用免疫荧光实验对作为细胞凋亡标志的Caspase-3活性进行测定.结果:人参皂苷Rh2对人肺腺癌A549细胞毒活性明显存在构效关系,其中25 mg·L-1的20(R)-人参皂苷Rh2和20(S)-人参皂苷Rh2作用48 h对肿瘤细胞株A549的增殖抑制率分别为28.5%,33.6%,IC50值分别为33.4,28.5 mg·L-1.20 mg·L-1的20(S)-人参皂苷Rh2作用A549细胞24 h后g0/G1期细胞比例显著高于对照组(P＜0.01),S期细胞比例显著低于对照组(P＜0.01),G2/M期细胞比例与对照组比较无显著性差异,说明20(S)-人参皂苷Rh2能阻滞细胞周期于G1期.30 mg·L-1的S型和R型人参皂苷Rh2作用A549细胞24 h后,无论是早期还是晚期凋亡率均明显高于正常组细胞(P＜0.05),并且20(S)-人参皂苷Rh2组早期凋亡率明显高于20(R)-人参皂苷Rh2组,表现出明显的构效效应(P＜0.05).20(R)-人参皂苷Rh2和20(S)-人参皂苷Rh2作用6 h的A549细胞中标记Caspase-3活性的荧光亮度明显增强,说明Caspase-3的激活参与了人参皂苷Rh2诱导的A549细胞凋亡.结论:S型和R型人参皂苷Rh2均可剂量依赖性地抑制A549细胞增殖,并且20(S)-人参皂苷Rh,的抗肿瘤活性明显强于20(R)-人参皂苷Rh2,阻滞细胞周期于G1期,具有构效效应;S型和R型人参皂苷Rh2均具有促进A549细胞凋亡作用,并且20(S)-人参皂苷Rh2组早期凋亡率明显高于20(R)-人参皂苷Rh2组,具有构效效应.     

Growth inhibitory activity of biflavonoids and diterpenoids from the leaves of the Libyan Juniperus phoenicea against human cancer cells

Three biflavonoids [cupressuflavone ( 1 ), amentoflavone ( 2 ), and sumaflavone ( 3 )], four diterpenoids [13‐epi‐cupressic acid ( 4 ), imbricatholic acid ( 5 ), 3‐hydroxy‐sandaracopimaric acid ( 6 ), and dehydroabietic acid ( 7 )], and one lignan [β‐peltatin methyl ether ( 8 )] were isolated from the cytotoxic fractions of the extracts of the leaves of the Libyan Juniperus phoenicea L. The structures of these compounds were elucidated by spectroscopic means. Cytotoxicity of compounds 1 – 6 were assessed against the human lung cancer cell line A549 using the MTT assay. Compounds 1 and 3 showed cytotoxicity against the A549 cells (IC₅₀ = 65 and 77 μM, respectively), whereas compound 2 did not show any activity. Diterpenes 4 – 6 exhibited weak cytotoxicity against the A549 cells with the IC₅₀ values of 159, 263, and 223 μM, respectively. The cytotoxicity of each compound was compared with the anticancer drug, etoposide (IC₅₀ = 61 μM). Cupressuflavone ( 1 ) was evaluated also for cytotoxicity against both the human PC3 cancer cell line and the normal prostate cell line (PNT2), and this compound revealed a high degree of cytotoxic selectivity towards the prostate cancer cells (PC3), with IC₅₀ value of 19.9 μM, without any evidence of cytotoxicity towards the normal prostate cell line (PNT2).     

黄芪甲苷对人参皂苷CK肿瘤细胞摄取及抗肿瘤作用的影响

目的考察黄芪甲苷(AS-IV)对人参皂苷CK(GCK)肿瘤细胞摄取和抗肿瘤药效的影响。方法采用人非小细胞肺癌细胞A549作为肿瘤细胞模型,通过MTT法比较两者配伍与单用GCK的细胞毒性;用荧光法和HPLC法考察了AS-IV与配伍GCK后细胞对GCK的摄取率变化,建立裸鼠荷瘤模型考察AS-IV对GCK的体内增效作用。结果配伍AS-IV后,GCK对A549细胞的生长抑制作用增强,肿瘤细胞对GCK的摄取增加,且随着AS-IV比例的升高,效果更加显著。荷瘤小鼠实验表明,AS-IV增加了GCK的体内抗肿瘤作用。结论 AS-IV配伍GCK具有增强GCK抗肿瘤药效的作用。     

麦门冬汤加减联合顺铂对A549细胞化疗增敏的作用机制

目的:通过体外实验观察麦门冬汤加减(modified Maimendong Tang)联合顺铂(cisplatin)对人肺腺癌A549细胞增殖,凋亡及侵袭转移能力及对半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的蛋白表达量的影响,探讨麦门冬汤加减方化疗增敏的作用并研究其相关机制。方法:分别用麦门冬汤加减(15 g·L-1),顺铂(9 mg·L-1),联合药物干预肺腺癌A549细胞,实验分为空白组、麦门冬汤加减组、顺铂组、麦门冬汤加减+顺铂组。利用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同质量浓度(0,5,10,15,20,25 g·L-1)麦门冬汤加减和不同质量浓度(0,3,6,9,12,15 mg·L-1)顺铂干预A549细胞24,48,72 h后的增殖能力,检测各组A549细胞的增殖能力;流式细胞术分析各组的凋亡程度及周期的变化;划痕实验和transwell小室实验检测各组的侵袭转移能力;蛋白免疫印迹法检测各组Caspase-3,EGFR蛋白表达的变化情况。结果:与空白组比较,麦门冬汤加减,顺铂干预A549细胞后呈浓度依赖性、时间依赖性抑制细胞的增殖(P0.05);各药物组均能抑制A549细胞增殖能力,减弱划痕愈合能力,减少穿过transwell小室的细胞,促进细胞凋亡,下调Caspase-3,EGFR蛋白表达(P0.05)。与单独给药组比较,麦门冬汤加减与顺铂联合应用后更能明显抑制肺腺癌A549细胞增殖能力和更能诱导A549细胞的凋亡,G0/G1期的细胞增多更明显,S期的细胞明显减少(P0.05);联合用药后,细胞划痕愈合能力明显减弱,穿过transwell小室的细胞明显减少,Caspase-3,EGFR的蛋白表达量下降更明显(P0.05)。结论:麦门冬汤加减与顺铂合用后抑制肺癌细胞A549增殖及侵袭转移能力,诱导细胞凋亡,两者存在协同增敏作用,其相关机制可能与下调Caspase-3,EGFR的蛋白表达相关。     

粗吻海龙蛋白质组分体外抗肿瘤活性的研究

 目的探讨粗吻海龙水溶性蛋白质组分的抗肿瘤活性。方法应用四甲基偶氮唑盐法检测药物细胞毒效应,应用流式细胞术分析药物对A549细胞周期和凋亡率的变化,琼脂糖凝胶电泳、荧光显微镜观察药物对A549细胞凋亡和细胞周期相关性质改变。结果粗吻海龙蛋白对L1210、CCRF-CEM、A549、LOVO细胞的IC₅₀分为1.86,1.56,0.88,1.74 g·L^-1。粗吻海龙蛋白质组分对A549细胞作用表现出凋亡细胞特征性的改变,并能增强甲氨蝶呤、丝裂霉素对A549的细胞毒作用。结果粗吻海龙蛋白质组分对肿瘤细胞增生有明显的抑制作用,可引起肿瘤细胞凋亡。     

中药臭灵丹中黄酮类化合物的体外抗肿瘤活性研究

目的:探讨中药臭灵丹中黄酮类化合物的体外抗肿瘤活性。方法:采用MTT法,检测分离自臭灵丹的6个黄酮类化合物对2种正常细胞的毒性和对2种肿瘤细胞的增殖抑制作用,并初步分析它们的构效关系;运用流式细胞仪,检测活性化合物对细胞凋亡率及细胞周期的影响。结果:6个黄酮化合物中,5,7,3,′4′-四甲氧基-3-羟基黄酮与金腰素乙显著抑制A549和HeLa 2种肿瘤细胞的增殖并呈浓度依赖性关系,且对正常细胞Vero和EVC304的毒性较小;这2个黄酮结构中均有邻位酚甲氧基。流式结果显示金腰素乙对HeLa细胞的G2/M期起阻滞作用并呈浓度依赖性关系。5,7,3,′4′-四甲氧基-3-羟基黄酮与金腰素乙对A549和HeLa细胞都有促凋亡作用并呈明显的量效关系。结论:5,7,3,′4′-四甲氧基-3-羟基黄酮与金腰素乙对肿瘤细胞的生长有显著的抑制增殖作用且细胞毒性小,并通过调节细胞周期及诱导凋亡发挥抗肿瘤作用。     

鸡血藤抗肿瘤有效部位诱导A549肺癌细胞非凋亡性程序化死亡的研究

目的：探讨鸡血藤抗肿瘤有效部位(SSCE)对人非小细胞肺癌A549细胞的杀伤特点和作用机制。方法：采用四氮唑溴盐(MTT)法、绘制生长曲线观察药物对A549细胞增殖的影响。采用流式细胞术分析药物对肿瘤细胞周期的影响。通过HE染色和激光共聚焦扫描荧光显微镜技术、AnnexinV-PI双标法，Caspase-3活性检测以及DNA琼脂糖凝胶电泳，观察药物对细胞凋亡的诱导作用。结果：SSCE对A549细胞有明显杀伤作用，24 h药效最强，IC₅₀为25.54 mg·L^-1。细胞周期分析显示，药物作用12 h，S期细胞增多，G₀-G₁和G₂-M期细胞减少，细胞周期变化在24 h后明显减弱，48 h恢复正常。形态学观察可见，药物作用短时间内(8～12 h)，细胞核发生皱缩扭曲，胞浆内出现较多空泡及颗粒状物，胞膜完整；随后细胞核固缩。细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻在用药后12 h最显著，具有时间-剂量依赖关系。Caspase-3活性无明显升高，且与剂量成反比。DNA琼脂糖凝胶电泳未见片断化梯形条带。结论：SSCE对A549细胞具有直接杀伤作用，药效迅速，细胞周期受到干扰(S delay)，主要表现为非凋亡性程序化细胞死亡。