利用基因芯片技术研究电击伤后心肌组织基因表达谱的改变

目的研究电击伤后心肌组织基因表达谱的改变,筛选与心肌电损伤过程相关的差异表达基因.方法将大鼠心脏电击伤3 h后的心肌组织(电击组)和正常心肌组织(对照组),分别提取总RNA,制备Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的标记的cDNA探针,并与BioStar-40基因芯片进行杂交.杂交信号经扫描后,计算机分析基因表达情况.结果电击伤后心肌组织中共有71个基因或EST发生差异表达,其中35个基因或EST表达上调,36个基因或EST(expressed sequence tags)表达下调.这些基因涉及凝血、炎症反应、信号转导及机体自稳态等多个方面,此外还有44个基因或EST的功能是未知的.结论利用基因芯片技术初步筛选出与心肌电损伤过程相关的多个差异表达基因,为揭示心脏电击伤的分子机制提供了依据.     

胃癌相关基因EST片段的筛选与gcI基因克隆

目的：结合生物信息学手段和实验途径研究mRNA差异显示方法得到的胃癌相关差异表达基因片段的特性。方法：mRNA差异显示技术筛选出的9条胃癌相关基因EST片段，通过国际互联网基因组数据库资源，分别使用BLAST软件将所得到的序列与EST数据库和基因组数据库进行比对分析，获得胃癌表达基因片段的特征信息。应用5＇RACE方法延伸序列I,BioEdit软件对延伸的序列进行ORF分析，Northern印迹检测其在各种胃组织中的表达。结果：3条序列与已知基因序列同源，1条序列与CD98A的外显子同源，1条与SPTANl同源，1条与RPS24l司源；显示有3条序列与非编码区长散布核元件LINE区域匹配；3条为新的EST序列，其中1条获得eDNA全长序列，具有完整的读码框，编码120个氨基酸，命名为gcI，定位于染色体10q21—22。Northern验证gcI在胃癌组织中表达上调。结论：利用生物信息学方法对胃癌差异显示序列进行筛选，筛选出3条序列与已知基因同源；3条序列为新EST。对其中1条克隆全长序列，它可能参与了胃癌的发病过程。     

高血压患者及大鼠线粒体ATPase 6基因的克隆、表达与突变研究

目的：研究正常血压与高血压鼠以及正常血压与高血压患者的差异基因。方法：用差别杂交法（Differentialhybridization）筛选正常人心脏cDNA文库的部分克隆,得到多个在自发性高血压鼠（SHR）心肌和高血压患者外周白细胞中高表达的线粒体基因。重组质粒,PCR－SSCP和测序,进行基因突变分析。结果：SHR鼠心肌线粒体ATPase6基因构象改变,8701位碱基由G→A（G8701A）,编码的第59位氨基酸密码子由丙氨酸变成苏氨酸;A8708G,编码的第61位氨基酸由组氨酸变成精氨酸。高血压病患者外周血白细胞线粒体ATPase6基因8584位碱基突变（G8584A）,编码的第20位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸,这一变化与SHR线粒体ATPase6基因改变相一致。结论：高血压病患者外用血白细胞线粒体ATPase6基因G8584A突变很可能在高血压病心肌肥厚的发生、发展中具有意义,并可能是高血压病的特异性改变。     

精子细胞中基因表达谱的研究

目的 研究成熟精子细胞中的基因表达。方法 采用限制性显示PCR（RD－PCR）获得大量正常和异常精子细胞中基因表达序列标签（EST）并以表达谱图的方式显示出来。结果 通过RD－PCR技术得到大量正常精子细胞和异常精子细胞的EST及部分差异表达EST。结论 RD－PCDR技术既能针对已知基因又能针对未知基因，快速收集大量长度适宜、大小均一、适于芯片制备的EST，较通过cDNA文库等方法得到靶基因片段具有独特的优势。     

小鼠小肠上皮内淋巴细胞与脾T淋巴细胞间基因表达差异分析

目的：比较小鼠小肠上皮内淋巴细胞（intestine intraepithelial lymphocyte，iIEL）与脾脏T淋巴细胞的基因表达差异，建立两者的cDNA差异减除文库，分析iIEL优势表达的基因。方法：采用Percoll密度梯度法分离iIEL，尼龙毛柱法分离脾脏T淋巴细胞。应用改良后的差减杂交法，连接特异的衔接子，通过减除杂交从iIEL中去除与脾T淋巴细胞相同的表达基因后，经抑制性PCR扩增，并与质粒载体连接，得到二者的cDNA减除文库。用Northern印迹分析法从中筛选iIEL优势表达的EST。结果：从iIEL特异的cDNA减除文库中筛选出50条有明显差异的EST，进行测序，并取得登录号。对所得EST用基本局域联配搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行比对，分析得出14个iIEL优势表达的基因。这些基因分析与病原体的模式识别、细胞因子相关信号转导以及蛋白酶抑制剂有关。结论：iIEL是肠道天然免疫的重要组成部分，能识别细菌的保守抗原。细胞因子是影响其行为的重要方式，而某些信号转导途径通常可能因为高表达蛋白酶抑制剂而受抑。     

小鼠胸腺增龄相关性基因的差异表达及其克隆

目的 小鼠胸腺增龄相关性基因差异表达研究及其克隆。方法 利用DDRT－PCR技术对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行分析,获得差异表达片段（ESTs)。进一步作Northern印迹分析并进行核苷酸测序。选取其中一个EST为探针,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆基因。结果 对1月龄和10月龄小鼠胸腺mRNA差异表达进行DDRT－PCR分析,发现小鼠胸腺基因存在增龄相关性的表达差异,某些基因在1或10月龄胸腺内有选择性表达,某些基因仅有表达量的变化。共获得108个差异表达的ESTs,其中31个呈Northern印迹阳性,全部测序。经同源性分析,有14个ESTs与已知基因有较高的同源性,17个ESTs为新的cDNA片段。选取其中1个在1月龄鼠胸腺水平表达的EST,从小鼠胸腺cDNA文库中克隆到1个与小鼠的LAF1转酮醇酶高度同源的1480bp片段。结论 小鼠胸腺内存在增龄性基因表达差异。据此差异所获得的胸腺差异表达基因可能参与胸腺衰老与萎缩过程。     

自发性高血压大鼠细胞凋亡相关基因蛋白的研究

目的：研究自发性高血压大鼠(SHR)心肌细胞Bax和Bcl-2基因蛋白表达的变化及其与心肌细胞凋亡的关系。方法：采用免疫组化和末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测Bax和Bcl-2基因蛋白及凋亡细胞。结果：(1)心肌细胞凋亡和Bax基因蛋白表达在1月龄SHR组(NLVH组)和18～20月龄SHR组(CHF组)显著增高且Bax基因蛋白表达与心肌细胞凋亡呈显著正相关(P均＜0.01)。(2)在10月龄SHR组(LVH组),心肌细胞凋亡显著降低但Bcl-2基因蛋白表达显著增高且Bcl-2基因蛋白表达与心肌细胞凋亡呈显著负相关(P均＜0.01)。(3)NLVH组和CHF组Bcl-2/Bax比例显著降低,但LVH组Bcl-2/Bax比例显著增高且Bcl-2/Bax比例与心肌细胞凋亡呈显著负相关(P均＜0.01)。结论：SHR心肌细胞Bax和Bcl-2基因蛋白表达及心肌细胞凋亡存在动态变化,且Bax基因蛋白表达上调可能与SHR心肌细胞凋亡增加和CHF相关而Bcl-2基因蛋白表达上调则可能与SHR心肌细胞凋亡减少和LVH有关。因此,Bax和Bcl-2基因蛋白表达的动态变化可能在SHR心肌细胞凋亡和心脏重构中起重要作用。     

用基因芯片技术检测宫颈癌患者相关基因的差异表达

目的:研究感染HPV18的宫颈癌组织中差异表达的基因,并进一步探讨HPV18致宫颈癌发生的机制。方法:采用杂交捕获Ⅱ代技术筛选出3例感染HPV18的宫颈癌病例,取癌组织及自身正常宫颈组织标本,用含14 112条人类全长基因的cDNA微阵列芯片筛选出差异表达的基因并进行分析。结果:在3例宫颈癌组织中共同差异表达的基因有1 315条,其中649条上调,666条下调。这些基因涉及原癌基因和抑癌基因、细胞周期蛋白类、细胞信号和传递蛋白、代谢、免疫相关、细胞受体、蛋白翻译合成以及其它一些未知功能的基因。结论:HPV18引发宫颈癌是多因素多基因共同作用的结果,它们通过相互调节、网络调控直接或间接地导致宫颈癌的发生发展,可望进一步分析证实以明确HPV引发宫颈癌的精确分子机制。     

伴有高血压的糖尿病大鼠大血管病变SMC增殖早期基因表达谱的研究

目的:建立糖尿病大血管病变平滑肌细胞(SMC)增殖早期基因表达谱.方法:以自发性高血压大鼠(SHR)为对照,以STZ诱导SHR构建伴有高血压的糖尿病大鼠模型为实验组,分别在1周、2周、4周时抽提胸主动脉中膜的总RNA,获得两组cDNA的探针,与含有4 096条大鼠全长基因的cDNA表达谱芯片杂交,扫描芯片荧光信号图像,对差异表达基因数据进行生物信息学分析.结果:1周时有差异表达的基因321条,160条基因表达下降(ratio<0.5),161条基因表达上升(ratio>2).2周、4周时上述数据分别为414、238、176和403、202、201.分级聚类分析归为8类,3期全部高表达已知基因13条,其中4条持续升高的基因(CD74、Irf1、GAP43、CD36)都与细胞增殖有关.CYP2E1基因的表达大幅上调(ratio 1 w=34.54; ratio 2 w=24.82; ratio 4 w=33.57).结论:糖尿病大血管病变SMC增殖是多基因综合改变的结果,细胞增殖相关基因高表达是主要病理基础,CYP2E1基因可能是糖尿病大血管病变SMC增殖较重要或关键的基因.     

鼻咽癌相关肿瘤抗原基因的筛选及鉴定

目的 通过筛选鼻咽癌肿瘤抗原，为鼻咽癌提供一个早期诊断指标；同时为进一步研究鼻咽癌的免疫治疗莫定基础。方法 应用鼻咽癌细胞株异种免疫血清，采用血清学筛选重组cDNA表达文库（SEREX）技术对鼻咽癌cDNA表达文库进行筛选，对阳性克隆测序并进行生物信息学分析。Western Blot检测鼻咽癌及正常人血清中阳性克隆的抗体。结果 共筛选出18个阳性克隆，其中包括MAGE基因、CREM基因、β2-微球蛋白以及核糖体蛋白等已知基因或表达序列标签（EST），另外有6个基因或EST在GenBank数据库中没有同源性，可能是新基因或EST。选取NPC-14、NPC-15、NPC-18克隆进行鼻咽癌患者及正常人群血清的检测，结果显示鼻咽癌患者的阳性率明显高于正常人群。结论 所获得的未知基因产物有可能成为早期诊断鼻咽癌的血清学标志物。     

白细胞介素—6相关新基因的生物学分析

目的：通过白细胞介素－6（IL－6）相关新基因的生物学分析，研究IL－6的作用机制。方法：利用IL－6相关表达序列标签（EST）进行电子克隆获得924bp全长新基因，后采用RT－PCR方法从IL－6激活的人U937细胞所提的总RNA中钓取，此片断连到pGEM-Teasy质粒上并测序。结果：成功钓取了IL－6相关EST电子克隆的全长cDNA基因。结论：使用电子克隆技术对于发现新基因有重要的指导意义。     

活血潜阳颗粒对自发性高血压大鼠大脑组织基因表达谱的影响

目的采用基因芯片技术研究活血潜阳颗粒对自发性高血压大鼠（SHR）脑组织基因表达谱的影响,探讨该药保护高血压靶器官的分子机制。方法12只20周龄雄性SHR随机分为干预组（活血潜阳颗粒组）和对照组;从脑组织中抽提mRNA,经逆转录分别用Cy3、Cy5荧光标记,获得2组动物来源的cDNA探针;cDNA探针与基因表达谱芯片杂交,结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果SHR给予活血潜阳颗粒药物干预8周后,收缩压明显下降。全基因表达谱差异表达基因共有1290个,下调的基因有611个,361个能在Genbank上登陆;上调的基因679个,360个基因能在Genbank上登陆。其中活血潜阳颗粒组SHR脑组织中Wif-1、Ppp2ca、EPO、Crk、Daxx、PPARδ等存在显著基因差异表达。这些表达差异基因涉及Wnt、JAK-STAT、MAPK、PPAR等多个信号传导通路。结论活血潜阳颗粒可能通过Wnt、JAK-STAT、MAPK、PPAR等信号传导通路相关基因的干预从而对高血压慢性脑损害起一定防治作用。     

利用cDNA微阵列进行宫颈鳞癌的分子筛查

目的使用cDNA微阵列筛选浸润性宫颈鳞癌的淋巴结转移相关基因。方法应用包含18 432个基因的cDNA微阵列测定IB期宫颈鳞癌的全基因序列,包括已知功能的人类转录子和表达序列标签ESTs,分为正常组、淋巴转移组、无淋巴转移三组宫颈组织。为了证实不同的基因表达,选择3个基因进行了冰冻组织的RT-PCR检测和石蜡组织的免疫组化检测。结果经统计学分析,与无淋巴转移浸润性宫颈鳞癌组织比较,有淋巴转移的癌组织有677个基因大于2倍差异,其中上调494个(72.97%),下调183个(27.03%),表达序列标签EST为61个(9.01%),这些基因涉及代谢、发育、信号传导、分化、DNA结合转录和离子通道等。6倍差异基因14个,其中只有nel(chicken)like-2下调,其余为上调基因。RT-PCR和免疫组化的结果与cDNA微阵列结果一致。结论利用cDNA微阵列检测基因的表达状态可以预测宫颈鳞癌淋巴结转移和宫颈癌的预后情况。Cx43的低表达、ETV5和整合素alpha 2的高表达可能会成为评估浸润性宫颈鳞癌恶性程度的重要指标。这些分子有利于预测浸润性宫颈鳞癌的预后及其相应的分子治疗。     

用抑制性消减杂交方法筛选人肾癌相关基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人肾癌差异表达基因文库并进行差异表达基因筛选.方法 以肾癌细胞株RLC-310和肾近曲小管细胞株HK-2互为实验组和对照组,提取mRNA,应用抑制性消减杂交技术进行正反两向消减杂交,获得人肾癌细胞差异表达基因文库,结合反向Northern斑点印迹杂交,筛选差异基因克隆,并进行测序分析.结果 正向和反向文库共包含1200多个阳性克隆,经斑点杂交筛选后,对213个差异克隆进行测序并经BLAST分析,得到144个差异表达基因,与肾癌相关的高表达基因67个,低表达基因77个,其中新EST 14个,未知功能基因21个;对测序基因进行聚类分析发现与细胞生长、黏附、凋亡等肿瘤细胞生物学行为相关.结论 该文库质量可靠,所筛选出的差异基因和新的基因为进一步筛选肾癌特异性相关基因,绘制肾癌差异基因表达谱,最终阐明肾癌发生、发展、转移机制提供了实验材料和研究靶点.     

利用全基因组寡核苷酸筛选大肠癌差异表达基因

目的筛查人大肠癌组织与相应正常大肠粘膜差异表达基因。方法应用美国AffymetrixHG—U133寡核苷酸芯片（代表迄今所知的32264个人类全基因．包括19308个已知的人类基因和12956个EST簇）检测9例大肠癌组织及相应正常大肠粘膜基因表达谱，并以实时荧光定量PCR技术对基因芯片检测结果进行验证；综合运用交集补集、秩和检验及t检验比较两组表达谱数据结果获得大肠癌组织与正常大肠粘膜组织差异表达基因和ESTs3125个（包括肿瘤上调基因ESTs974个、下调基因ESTs2151个）；大肠癌组织表达而相应正常粘膜不表达的ESTs245个：大肠癌组织不表达而正常粘膜表达的ESTs162个；最重要的大肠癌差异表达基因ESTs17个。本研究所筛得之大肠癌差异表达基因80．1％未见报道。结论综合运用交集补集分析、t检验、秩和检验对基因谱数据进行挖掘的策略，可为寻找大肠癌分子标记物和从整体上探讨大肠癌发生的分子机制奠定基础。     

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF cDNA FRAGMENTS AND FULL-LENGTH cDNA DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN HUMAN GLIOBLASTOMA CELL LINE BT-325 VERSUS ALL-TRANS RETINOIC ACID INDUCTION

Objective. To investigate the differentiation process of the human glioblastoma cells. Methods. Differential display reverse transcribed-PCR(DDRT-PCR) was used to isolate the genes differentially expressed in control and all-trans retinoic acid treated human glioblastoma cell line BT-325. Routine method of cDNA library screening was performed to clone full-length cDNA. Results. Thirty-six RT-PCR reactions were performed and 64 differentially expressed fragments were recovered, amplified and cloned. Of them,46 ESTs were sequenced and delivered into the GenBank. The homology comparison us-ing BLAST algorithm revealed that 22ESFs are highly homologous with the known genes and many of them play impor-tant roles in the cell differentiation progress. A dot-blot hybridization was conducted to certify the differemiation expres-sion. The result showed that 27 EST clones are expressed at different level in control and all-traus retinoic acid treated BT-325 cells. A full-length cDNA was cloned using the EST-HGBB098.Conclusion. DDRT-PCR was a simple and effective method to segally analyze the differentially expressed genes.     

人脐静脉内皮细胞脂多糖刺激后上调基因表达谱的分析

目的 对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)受脂多糖(LPS)刺激后上调基因表达谱进行筛选及分析。方法 以受LPS刺激HUVEC为实验方，末刺激别HUVEC为驱使方，进行抑制消减杂交(SSH)建立消减cDNA文库，经菌落原位斑点杂交筛选文库后将阳性克隆测序和同源性分析，并用RT-PCR验证新的cDNA序列。结果 共获得25条上调表达的基因，分别与炎症反应、细胞骨架重构、细胞生长和凋亡、胞内信号转导相关，并克隆到3条新基因表达序列标签(EST)，RT-PCR验证了这些新EST序列只在LPS刺激的内皮细胞中表达。结论 抑制消减杂交有效地克隆了人脐静脉内皮细胞LPS刺激后上调表达基因，有助于阐明LPS直接激活血管内皮细胞的分子机制。     

正常及饥饿大鼠胃壁组织基因表达谱的研究

目的通过荧光芯片技术从整体水平研究正常及饥饿大鼠胃壁组织基因表达谱,探讨饥饿大鼠胃壁组织基因表达的变化。方法用SD大鼠建立正常和饥饿两种模型,动物断头取胃壁组织抽提RNA,荧光芯片杂交,并对实验结果采用real-timePCR、Northern blot和Western blotting方法验证。结果在由基因或表达序列标签(ESTs)组成的9233个杂交点的大鼠基因芯片上,共有504个在饥饿大鼠胃壁组织呈差异表达。其中263个为已知基因,87个为已知的ESTs。在差异表达的基因或ESTs中,上调262个,下调242个,这其中包括与细胞信号转导、细胞结构运动等相关的基因或ESTs。经初步验证,芯片数据的可靠性达80%。结论利用荧光芯片技术研究正常及饥饿大鼠胃壁组织的基因表达谱,可以大规模、高通量发现胃在饥饿状态发生改变的基因,为进一步阐明饥饿胃肠生理、寻找新的与能量代谢及食欲调节相关的基因以及发现基因的新功能奠定基础。