糖尿病大鼠早期肾脏病变相关新基因Dmrs91克隆及其生物信息学分析

对合并早期肾脏病变的糖尿病大鼠肾脏进行cDNARDA获得的新EST序列进行全长cDNA克隆即新基因Dmrs91,并对该基因进行生物信息学分析。     

糖尿病性心肌病变凋亡相关新基因2ass-bnip3的电子克隆及其功能预测

对应用荧光标记的mRNA差异显示分析技术筛选获得的2型糖尿病性心肌病变凋亡相关新基因2ass—bnip3，进行全长克隆及其结构／功能预测，获得1594bp的新基因全长及其编码的具187个氨基酸的蛋白2ass—bnip3-p，它可能通过钙调-凋亡调节通路而在糖尿病心肌病变的发生中发挥重要作用。     

人血清IA-2抗体检测方法的建立及应用

目的建立糖尿病患者血清中IA-2自身抗体的检测方法.方法以原核表达的人IA-2融合蛋白作为抗原建立人血清IA-2抗体的固相酶联免疫吸附检测方法(ELISA),该方法经优化后用于糖尿病患者血清中IA-2抗体的检测.结果该文所建立方法的平均批内和批间变异系数分别为6.8%和7.7%;回收率为99.2%～105%.所测定的1型和2型糖尿病患者血清中IA-2抗体的阳性率分别为49%和3.6%.结论应用原核表达的人IA-2蛋白为抗原所建立的ELISA方法简单且可靠,为糖尿病患者血清中IA-2抗体的检测提供了条件.     

受血糖调控的定点突变胰岛素原真核表达载体的构建

目的构建受血糖调控的含葡萄糖-6-磷酸酶(G6p)启动子的定点突变胰岛素原基因真核表达载体.方法应用基因突变技术(重叠延伸拼接法)改变胰岛素原C肽两端的氨基酸序列,使之能被存在于大多数细胞中的furin酶所识别并剪切为成熟的胰岛素,新序列命名为INS/furin;应用基因重组技术将G6p启动子序列替代真核表达载体pIRES中的CMV启动子序列,并将INS/furin亚克隆至pIRES的多克隆位点B.结果SgfⅠ和Sac Ⅰ、XbaⅠ和NotⅠ两种组合的双酶切及特定引物测序均证实载体构建成功.结论带有G6p启动子的含定点突变胰岛素原基因的真核表达载体有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体.     

β细胞素对体外培养大鼠胰岛的影响

研究β细胞素(BTC)对体外培养大鼠胰岛的作用。BTC无促胰岛急性分泌作用,但对长期培养大鼠胰岛的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)具有一定保护效力;实时PCR及免疫荧光检测胰高血糖素、胰岛素、PDX-1、葡萄糖转运子2的表达未随培养时间延长而丰度下降,BTC可能不是通过调节上述基因的表达来维护胰岛GSIS功能的。     

甲状腺激素反应蛋白1的原核生物表达

目的 应用基因工程技术表达甲状腺激素反应蛋白1(TRP-1)。方法 应用RT-PCR方法，从新生大鼠脑组织RNA中扩增编码TRP-1的cDNA片段，构建表达型重组质粒，经DNA序列分析确证后，在大肠杆菌中表达，以Western印迹来初步鉴定是否表达了目的融合蛋白，用亲和层析纯化融合目的蛋白，并以SDS-PAGE电泳测定其相对分子质量。结果 所获特异PCR产物正确地重组入Pinpoint Xa-1表达载体中。Western印迹表明经异丙基硫代半乳糖苷诱导的原核细胞表达产生了目的融合蛋白，亲和层析得到了纯度较高、相对分子质量约23400的融合目的蛋白。结论 应用原核细胞表达体系成功地表达了TRP-1融合蛋白，为进一步研究其在脑发育中的所起的作用以及该蛋白的其它功能提供了可能。     

受血糖调控的定点突变胰岛素原真核表达载体的构建

目的 构建受血糖调控的含葡萄糖-6-磷酸酶(G6p)启动子的定点突变胰岛素原基因真核表达载体。方法 应用基因突变技术(重叠延伸拼接法)改变胰岛素原C肽两端的氨基酸序列，使之能被存在于大多数细胞中的furin酶所识别并剪切为成熟的胰岛素，新序列命名为INS／furin；应用基因重组技术将G6p启动子序列替代真核表达载体pIRES中的CMV启动子序列，并将INS／furin亚克隆至pIRES的多克隆位点B。结果SgfI和SacI、XbaI和NotI两种组合的双酶切及特定引物测序均证实载体构建成功。结论 带有G6p启动子的含定点突变胰岛素原基因的真核表达载体有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体。     

长期体外培养大鼠胰岛的动态研究

目的观察长期体外培养大鼠胰岛在分泌功能、基因表达及免疫荧光组织化学染色法的动态变化。方法采用胶原酶灌注消化和nextran密度梯度离心分离、纯化获得大鼠胰岛,连续培养20 d,定期检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS);实时聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光组织化学染色法检测胰高糖素(Glu)、胰岛素、胰腺十二指肠同源盒基因(PDX)-1、葡萄糖转运蛋白(Glut)-2基因mRNA及蛋白水平的表达。结果连续培养胰岛的GSIS水平持续下降;但RT-PCR及免疫荧光显示随培养时间延长,胰岛内关键基因表达并未见明显减弱。结论长期体外培养大鼠胰岛的胰岛素分泌功能持续下降,并非由胰岛素含量减少所致,可能存在更深层次的原因。     

雅培ALINITY i平台测定甲状腺激素TT3和FT3的性能评价

目的 对ALINITY i免疫发光测定系统检测游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)和总三碘甲腺原氨酸(total triiodothyronine,TT3)的性能进行验证,并评估新型ALINITY i系统6点校准体系和传统ARCHITECT系统6点校准体系检测对两项甲状腺激素(FT3和TT3)检测结果的一致性.方法 按照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)制定的指南文件和相关文献,对ALINITY i系统测定的FT3和TT3的精密度、最低检出限、线性和生物参考区间进行验证,并参考其中的CLSI EP9-A2文件对雅培ALINITY i系统6点校准体系和雅培ARCHITECT系统6点校准体系两种检测方法间的两项甲状腺激素检测结果进行方法学分析评价,并采用Pearson相关分析和Passing-bablok做数据比对分析.结果 ALINITY i系统6点校准体系检测FT3和TT3实验室内各水平总精密度均小于1/3 TEa,在可接受范围.通过线性验证试验证实上述两个项目在厂商声明的范围内呈良好的线性关系.生物参考区间与试剂厂商提供的参考区间数据相符.通过FT3和TT3两个检测项目评价两种检测方式的相关性和偏倚情况,FT3和TT3在雅培ALINITY i平台6点校准试剂检测和雅培ARCHITECT平台6点校准试剂检测的结果之间相关系数分别为0.996和0.987,斜率分别为0.998和0.924,两者检测结果之间有很强的相关性.结论 ALINITY i的免疫检测游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)和总三碘甲腺原氨酸(TT3)的性能符合既定的实验室设置标准,且关键性能参数与ARCHITECT高度一致.     

非肥胖2型糖尿病大鼠腹腔脂肪组织基因差异表达的鉴定

目的 研究非肥胖2型糖尿大鼠腹腔脂肪组织基因差异表达。方法 基因差异表达筛查使用代表性差异分析(cDNA RDA)技术；最终的差异产物经亚克隆、测序及生物信息学分析；半定量RT—PCR对筛查到的已知基因表达量进行初步的鉴定。结果 在大鼠脂肪组织中，发现7个高表达的表达序列标签(ESTs)，6个为新的ESTs，1个为已知基因[脂蛋白脂酶(LPL)基因]，其中1个EST与小鼠肌肉ERA-like GTPase(Era)基因部分相似(相似性约15％)。LPL基因在非肥胖2型糖尿病及高脂饮食组大鼠腹腔脂肪组织表达上调。结论 在大鼠腹腔脂肪组织中发现6个新的ESTs和1个已知基因高表达，其中1个EST与小鼠肌肉ERA—like GTPase(Era)基因部分相似。LPL基因表达上调可能与高脂饮食、高血脂、胰岛素抵抗及非肥胖2型糖尿大鼠分子发病机制相关。