人肺腺癌SPC-A1荷瘤裸鼠中RNAi靶向沉默FAK的作用

目的:通过用脂质体包裹靶向局部粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因的短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)质粒(shRNA-FAK),探讨该方法对荷瘤裸鼠中人肺腺癌SPC-A1的抑制效果.方法:用脂质体包裹shRNA-FAK,并通过尾静脉注射治疗荷瘤裸鼠,通过肿瘤生长曲线和重量,肿瘤组织形态学,肿瘤中的FAK蛋白表达情况、CD31、VEGF、PCNA和TUNEL检测,分析该方法对荷瘤裸鼠中人肺腺癌SPC-A1的抑制效果.结果:荷瘤裸鼠经过脂质体shRNA-FAK治疗后,肿瘤生长速度明显缓于对照组(P＜0.05),肿瘤重量明显低于对照组(P＜0.05).肿瘤组织的免疫组化、western blot和TUNEL检测显示与对照组相比,治疗组FAK蛋白表达降低(P＜0.05)、血管生成和细胞增殖均减少(P＜0.05)、凋亡细胞增加(P＜0.05),荷瘤裸鼠主要脏器形态学正常.结论:FAK特异性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能够在体内阻断FAK蛋白的表达,使组织内FAK蛋白的表达相应地减少,并进一步诱导肿瘤细胞的凋亡,最终导致肿瘤的生长速度减缓.     

趋化因子BLC表达载体构建及在肿瘤细胞中的表达

目的 建立真核表达重组体pcDNA-BLC的稳定转染细胞株，为研究趋化因子BLC的抗肿瘤免疫作用机制奠定基础。方法 以小鼠脾脏组织总RNA为模板，通过RT-PCR扩增BLC全长cDNA，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3．1( )真核表达质粒，构建重组质粒pcDNA-BLC，重组子经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定后，用脂质体转染技术导入Colon26细胞，经G418筛选建立稳定转染细胞株。用免疫印迹法(Western Blot)鉴定转染细胞表达的蛋白质，证实BLC存在。用趋化实验证实转染细胞株表达的BLC有生物学活性。结果 真核表达重组体pcDNA-BLC构建成功，pcDNA-BLC稳定转染细胞株表达有生物学活性的BLC。结论 成功建立了BLC的稳定转染细胞株，为研究BLC的抗肿瘤免疫作用机制继而发展肿瘤疫苗奠定了基础。     

SEREX方法筛选人胎盘抗原

目的 筛选并获得来自人胎盘有潜在应用价值的抗原.方法 基于血清学筛选重组cDNA表达文库(serological analysis of recombinant cDNA expression library,SEREX)技术,制备人绒毛组织免疫的兔血清,利用该免疫血清筛选人胎盘组织cDNA表达文库,通过两轮筛选得到免疫反应阳性的单克隆重组噬菌体并测序,并对所得到的序列进行生物信息学分析.结果 经过两轮筛选共得到69个阳性反应克隆,序列分析发现它们代表12种不同的基因序列,其中功能已知基因9个,功能未知基因3个,进一步分析发现绒毛膜生长催乳激素基因(CSH1和CSH2)有57个阳性反应克隆.占总数的82.6%,可能是一个具有重要功能的抗原基因.所筛选到的其他基因与胚胎生长发育相关.结论 SEREX技术筛选胎盘抗原是行之有效的,本实验筛选出的抗原基因对研究胚胎生长发育具有一定的意义.     

Adiponectin真核表达质粒的构建与表达研究

目的构建重组鼠adiponectin真核表达质粒,为进一步研究adiponectin的功能提供实验基础。方法提取鼠脂肪组织总RNA,运用RT-PCR方法扩增鼠adiponectincDNA完全编码区,将扩增产物连接至pCDNA3.1( )载体,对重组质粒进行测序验证,并检测其体外表达和对小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖抑制作用。结果重组真核表达质粒经PCR扩增后获得一744bp片段,并经测序证实,Western-blot检测到其体外表达。在体外的细胞学实验中,将重组质粒转染入小鼠乳腺癌细胞4T148h后,与对照组相比,可以观察到明显的细胞形态学改变,细胞体积变小皱缩,4T1细胞生长明显抑制。流式细胞术检测到该组细胞中凋亡细胞所占比例明显高于对照组。结论成功构建了鼠重组adiponectin真核表达质粒,该质粒对小鼠乳腺癌细胞4T1的增殖有明显的抑制作用。     

增强人波形蛋白表达可降低肝癌细胞的增殖和侵袭能力

目的 探讨波形蛋白(VIM)对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 构建VIM基因质粒载体pcDNA3.1-VIM,将VIM基因稳定转染人肝细胞癌HepG2细胞株,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot测定VIM的表达,分别用细胞增殖实验和标准的被覆基质胶侵袭小室,测定癌细胞的增殖活性和侵袭程度.结果 DNA序列分析和限制性核酸内切酶消化证实重组载体已正确克隆,建立的细胞株HepG2-pV在RNA和蛋白水平均稳定高表达VIM.HepG2-pV细胞增殖能力降低(P<0.05),软琼脂集落形成率为35.9%±3.9%,明显低于空质粒对照细胞(HepG2-P)和HepG2细胞(均P<0.05).HepG2-pV组侵袭细胞数为17±4,明显低于HepG2-P组和HepG2组(均P<0.05).结论 在体外增强肝癌细胞VIM表达,可以降低其恶性表型.     

应用细菌双杂交系统技术寻找与人PCIA1基因相互作用的基因

目的探寻与新近发现的人类交叉免疫反应抗原（homo sapiens cross-immune reaction antigen）基因PCIA1相互作用的基因,为其功能研究提供线索。方法应用Stratagene公司的细菌双杂交系统和人胚肾cDNA文库,构建诱饵质粒pBT-PCIA1,与靶质粒pTRG-cDNA文库大规模地共转化报告菌株,筛选并分离具有相互作用的pTRG-cDNA阳性克隆,经DNA序列分析和生物信息学确定靶基因。结果发现7种靶蛋白基因,其中3种基因功能尚不清楚,其余4种具有重要生理功能,突变或表达异常都会导致严重疾病;α-辅肌动蛋白-4（actinin,alpha4,ACTN4）、鞘脂激活蛋白原（prosaposin,PSAP）或真核翻译起始因子（eukary-otic translation initiation factor 3,subunit 10 theta,EIF3S10）过表达都会促进肿瘤发生和演进。结论细菌双杂交系统技术探测蛋白质之间的相互作用,是一种提供新基因功能研究信息的有效方法;PCIA1基因表达与肿瘤形成、侵袭和转移密切相关。     

靶向EGFR的RNA干扰诱导非小细胞肺癌细胞A549凋亡的研究

目的:探讨短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的靶向EGFR基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549的凋亡诱导作用。方法:构建靶向人EGFR基因的表达shRNA的质粒(pShEGFR),转染A549细胞,应用RT-PCR分析EGFR mRNA的表达情况,采用MTT法检测A549细胞的生长状况,通过流式细胞仪以及PI染色法进行细胞凋亡的定量检测和形态学分析。结果:pShEGFR转染组A549细胞中EGFR mRNA的表达水平,较转染同一载体连接无关序列的对照组(pShNEG组)、单纯脂质体组及PBS阴性对照组A549细胞均明显降低,F=425.640,P=0.000,其中较PBS阴性对照组细胞降低了74.5%。转染pShEGFR的A549细胞与3种不同对照组细胞相比,生长受到明显抑制,F=107.428,P=0.000,生长抑制率达54.9%,而转染pShNEG组和单纯脂质体组的A549细胞生长抑制率则分别为20%和3.1%。流式细胞仪检测结果显示,pShEGFR组细胞存在32.8%的凋亡率,PI荧光染色可见pShEGFR组细胞呈现出典型的凋亡形态学变化。结论:质粒介导的靶向人EGFR基因的pShEGFR能够有效地干扰NSCLC细胞系A549中EGFR基因的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长,诱导肿瘤细胞的凋亡。     

新基因PCIA1真核表达载体的构建及HeLa细胞稳定转染株的建立与鉴定

目的构建人的新基因（PCIA1）的真核表达载体，并将其载体稳定转染到HeLa细胞株中。方法以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）总RNA为模板，通过RT—PCR扩增PCIA1基因编码区eDNA，并将扩增的eDNA片段插入peDNA3．1（＋）真核表达质粒，构建重组质粒peDNA—PCIA1，重组子经酶切分析及测序鉴定后，用脂质体转染技术将该表达载体导人到HeLa细胞中，经G418筛选并建立稳定的转染细胞株，用RT-PCR和Westernblot检测PCIA1基因在HeLa细胞中的表达。结果经RT—PCR及Westernblot检测，证实真核表达重组质粒peDNA-PCIA1构建成功，PCIA1基因已经稳定转染到了HeLa细胞中并表达PCIA1蛋白。结论成功建立了人新基因PCIA1的稳定转染细胞株，为进一步研究PCIA1的功能奠定了基础。     

甘露聚糖修饰的重组小鼠甲胎蛋白的抗肿瘤免疫作用研究

目的研究用甘露聚糖修饰后的甲胎蛋白（AFP）对肿瘤免疫的促进作用。方法用小鼠建立原发性肝癌模型，以AFP作为模型抗原，将重组小鼠AFP（mAFP）与氧化型的甘露聚糖相连接制成疫苗（Ox-M-mAFP），同时用未与甘露聚糖连接的mAFP作为对照，研究该疫苗在小鼠体内的肿瘤免疫治疗效果。结果Ox-M-mAFP可在小鼠体内诱导出有效的抗肿瘤免疫反应，免疫后小鼠脾内得到的CD8^＋T淋巴细胞显示出对特异性分泌AFP的肿瘤细胞的杀伤活性。结论本实验提供了一种有效激活机体针对自身分子免疫应答的肿瘤疫苗策略，也对原发性肝癌的非手术治疗提供了一个可能的研究方向。     

RNA干扰PLK1基因诱导人前列腺癌细胞PC-3的凋亡研究

目的探讨质粒表达载体介导的RNA干扰抑制PLK1基因表达对人前列腺癌细胞PC-3增殖与凋亡的影响。方法构建靶向人PLK1基因的RNA干扰表达质粒（psh—PLK1）。将该干扰质粒转染到人前列腺癌细胞PC-3中，应用RT—PCR技术分析RNA干扰后各组细胞PLK1基因mRNA表达水平的变化。采用MTT法和细胞形态学分析检测PLK1基因表达受到抑制后PC-3细胞的增殖情况的变化，通过流式细胞分析技术以及PI染色技术进行对各组细胞进行细胞凋亡检测。结果RT—PCR结果显示，转染RNA干扰表达质粒（psh-PLK1）24h和48h后，实验组PC-3细胞较对照组的PLK1基因mRNA表达分别降低了74．6％和91．2％；转染了psh-PLK的PC-3细胞与对照组相比生长受到明显抑制（P〈0．05），而各对照组之间差异无显著性（P〉0．05）；流式细胞仪检测发现转染了psh-PLK1的PC-3细胞较对照组细胞产生了更强的细胞凋亡（39．2％），PI荧光染色可见实验组细胞呈现出典型的细胞凋亡形态学变化。结论RNA干扰PLK1基因能够有效地抑制PC-3细胞中PLK1基因的表达，从而抑制PC-3细胞的生长与增殖，并诱导PC-3细胞产生凋亡。