pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

人脑组织中STUB1基因的克隆构建及表达

目的 构建人STUB1基因全长cDNA的真核表达载体DNA3.1-STUB1.观察STUB1基因在人脑胶质瘤细胞(U251细胞)中的表达.方法 RT-PCR技术扩增获得人脑组织STUB1基因全长cDNA,将扩增的产物进行TA克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将STUB1基因酶切后构成pcDNA3.1-STUB1的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入U251胶质瘤细胞系,48h以后通过Western blotting实验观察重组质粒的表达情况.结果 RT-PCR扩增获得人脑组织中STUB1 cDNA全长912bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-STUB1,经DNA测序与GenBank中的人STUB1 cDNA序列一致.经neomycin(neo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株后,经过Western blotting显示转染重组质粒的细胞中有高水平的STUB1基因表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-STUB1真核表达质粒,并发现其在U251细胞中过量表达,为进一步研究STUB1基因在胶质瘤发生发展中的作用奠定了基础.     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

组织蛋白酶L基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒并进行表达鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人卵巢癌组织总RNA中逆转录CTSL基因的cDNA全长,克隆到pMDl8-T载体上;亚克隆至pcI)NA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和westeIn-blot检测CTSL基因和蛋白表达.结果:PCR克隆出CTSL cDNA全长,成功克隆人pMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,重组阳性克隆酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正确插入pcD-NA3.1载体.RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达.结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌中的作用提供了实验基础.     

pcDNA3.1+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1 -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1 -HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。     

人CXC型趋化因子受体CXCR6真核表达载体的构建及生物学功能研究

目的:克隆和构建带人CXC型趋化因子受体6(CXCR6)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+).CXCR6,分析瞬时转染CXCR6基因对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响.方法:Trizol一步法抽提人外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR扩增CXCR6全长基因,克隆入T载体,测序,双酶切连入真核表达载体peDNA3.1(+),酶切鉴定.将构建好的pcDNA3.1(+)-CXCR6瞬时转染.MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达.利用微孔隔离小室检测转入人CXCR6基因的MDA-MB-231细胞的迁移能力.结果:扩增出人CXCR6基因全长,测序结果和GenBank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).瞬时转染pcDNA3.1(+)-CXCR6显著增强MDA.MB-23l细胞的迁移能力.结论:成功构建带有人CXCR6基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-CXCR6,为CXCR6在肿瘤学中的研究奠定基础.     

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2真核表达载体的构建及在SHG-44细胞的表达

目的：为探讨O-糖基化在肿瘤发生发展及转移中的作用和功能，构建pcDNA3／ppGalNAc-T2真核表达质粒并转染人神经胶质瘤细胞SHG-44。方法：采用PCR技术从pDONR201-T2得到ppGalNAc—T2全长编码序列，亚克隆至真核表达载体pcDNA-3．1，脂质体介导基因转染人神经胶质瘤细胞SHG-44细胞，采用RT—PCR法检测重组质粒的表达。结果：酶切图谱分析和基因测序证实pcDNA3．1-T2真核表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞有12的表达。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1-T2，并成功转染入SHG-44细胞，为进一步研究ppGalNAcT2的功能奠定了基础。     

人APE1/Ref-1基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒pcDNA3.1 APE1,以期进一步研究该基因对细胞DNA损伤的保护作用.方法 采用RT-PCR法定向克隆人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段,构建pGM-T Easy/APE1质粒,测序鉴定APE1/Ref-1基因cDNA序列正确后,将目的片断亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1 上,构成pcDNA3.1 APE1表达质粒,并用Western blotting法检测转染人脐静脉内皮细胞APE1/Ref-1蛋白的表达水平.结果 经酶切及测序证实APE1/Ref-1基因真核表达质粒pcDNA3.1 APE1构建成功,Western blotting法检测到转染pcDNA3.1 APE1后,细胞内APE1/Ref-1蛋白表达明显增加.结论 成功构建含人APE1/Ref-1基因全长cDNA片段的真核表达质粒,为探讨APE1/Ref-1对细胞电离辐射损伤的保护作用奠定了基础.     

人CIDE3基因克隆和真核表达载体构建及促凋亡作用的研究

目的：克隆人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子3（CIDE3）全长基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并检测其促凋亡作用.方法：①提取人腹部皮下白色脂肪组织的总RNA,经RT-PCR获得CIDE3全长基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并进行序列测定.②用脂质体法将pcDNA3.1（＋）-CIDE3转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,通过TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果：①经RT-PCR扩增得到特异性717 bp的目的片段,构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3经序列测定,结果与Genbank发表的序列完全一致.②转染Hela细胞后,经Tunel染色法检测发现,转染pcDNA3.1（＋）-CIDE3后有大约25%的细胞发生了凋亡,与转染空质粒pcDNA3.1（＋）（＜5%）及未转染质粒的细胞相比,其凋亡细胞明显增多.结论：成功克隆了人CIDE3全长基因,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并验证了CIDE3基因可诱导细胞发生凋亡的生物学作用,为进一步研究CIDE3的生物学功能奠定了坚实基础.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的 构建人微小抗肌萎缩蛋白基因（microdystrophin）的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）,研究其体外表达情况。方法 限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒poD-NA3．1（＋）的Notl位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3．1（＋）／microdystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染人rMSCs中,经过G418筛选后。用RT—PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果 pcDNA3．1（＋）／microdystrophin经过Notl、HindⅢ酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录：对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光．说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论 成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染人rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达．为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达

目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒（HRSV）G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,酶切鉴定后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3．1（＋）G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到G基因有转录,Western blotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

THY1基因对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 构建THY1真核表达质粒,并探讨THY1基因对上皮性卵巢癌细胞系SKOV3生长的影响.方法 通过RT-PCR方法,从人正常卵巢组织中获得THY1基因,将其插入真核表达质粒pcDNA3.1( )中,构建成重组质粒pcDNA3.1( )-THY1,并转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆,经PCR、酶切及DNA测序鉴定;脂质体介导法转染SKOV3细胞并筛选稳定表达(SKOV3-THY1组),同时设空质粒转染组(SKOV3-Null组)和空白对照组(SKOV3组),RT-PCR和Western blotting鉴定重组质粒的表达情况;MTT法和流式细胞术检测THy1对SKOV3细胞生长和凋亡等生物学行为的影响.结果 经过PCR、酶切及DNA测序证实,外源性THY1基因正确插入到真核表达质粒pcD-NA3.1( )中,RT-PCR和western blotting证实此重组质粒已整合于SKOV3细胞并获稳定表达;MTT法结果提示SKOV3-THYl组的细胞抑制率(第5天的细胞抑制率为56.6%)明显高于SKOV3-Null组(12.5%)(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,SKOV3-THY1组凋亡率(31.8%)明显高于SKOV3-Null组(10.5%)和SKOv3组(9.8%),差异有统计学意义(P＜0.05),SKOV3-Null组和SKOV3组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了THY1真核表达质粒pcDNA3.1( )-THY1,该质粒转染SKOv3细胞可抑制其生长,THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用.     

甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达

目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中,通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性,可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成,被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗,通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。     

pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒在Chang Liver细胞中的表达和鉴定

[摘要] 目的 构建pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒并建立人正常肝细胞Chang Liver的稳定表达株。方法 采用RT-PCR法从HepG2细胞中克隆得到UBE2C cDNA全长序列, 将之与pMD18-T载体连接。双酶切和测序鉴定后,再将UBE2C片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。构建好的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,采用脂质体法将其转入Chang Liver细胞株中,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株,再用Western blot法检测转染后UBE2C的蛋白表达水平。结果 pcDNA3.1(-)/UBE2C质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因UBE2C的序列完全正确,真核表达质粒成功构建。Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组UBE2C的蛋白表达水平高于转pcDNA3.1(-)组,具有统计学意义（P﹥0.01）。结论 成功构建UBE2C基因的真核表达质粒并建立其稳定表达的Chang Liver细胞株,为下一步研究奠定基础。