Notch-1在骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的观察Notch-1信号在骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经细胞中的作用。方法采用RNA干扰技术,构建小鼠Notch-1shRNA,转染小鼠MSC后诱导其分化为神经细胞;同时以未转染MSC和转染甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)shRNA为对照。采用免疫细胞化学染色和Western印迹检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经微丝蛋白200(NF200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Notch-1蛋白表达;原位末端标记染色评价细胞凋亡率。结果诱导6d后,转染Notch-1shRNA诱导后细胞形成较典型的神经细胞形态,同时高效表达巢蛋白、NSE和NF200等,不表达GFAP,对照组无此现象。但是转染mNotch-1shRNA后细胞凋亡率(13·3%±2·3%)显著高于对照组。结论MSC的横向分化过程可能与神经干细胞类似,阻断Notch信号通路,会增加MSC向神经细胞分化的效果。     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

caveolin-1对大鼠骨髓间充质干细胞神经分化影响的原子力显微镜观察

目的 应用原子力显微镜观察大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经细胞的过程中细胞膜超微结构的变化,并探讨caveolin-1在其分化中的作用.方法 常规方法培养大鼠MSCs,采用RNA干扰技术,把Rn-siRNA-caveolin-1转染进第10代大鼠MSCs.采用RT-PCR法,分别检测转染组和未转染组大鼠MSCs caveolin-1的表达量,进行统计分析.盐酸法舒地尔诱导转染组和未转染组大鼠MSCs为神经元样细胞,并用免疫细胞化学法检测神经元特异性蛋白NSE、NF-M和GFAP的表达变化.用原子力显微镜分别在非接触模式和接触模式下观察MSCs成像及其细胞膜超微结构的变化.结果 ①未转染组MSCs表达caveolin-1,转染组MSCs表达caveolin-l-siRNA显著降低.②诱导前大鼠MSCs不表达神经元特异性蛋白NSE和NF-M.诱导后各组均表达NSE和NF-M.其中,转染组的NSE和NF-M的表达率显著高于未转染组.各组GFAP的表达率均小于5％.③原子力显微镜下观察,未转染组大鼠的MSCs以长梭形为主,细胞突起较多,且多集中于胞体一侧;转染组大鼠MSCs的细胞突起对称分布于胞体两侧.两个组均可见到大小不等的凹陷,环绕在细胞核周边,转染组的凹陷数量明显多于未转染组.结论 原子力显微镜下从细胞膜的水平观察,caveolin-1在大鼠骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞的过程中可能起到一定的作用.     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

维甲酸联合神经生长因子体外诱导人脐血间充质干细胞向神经样细胞定向分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(MSCs)向神经样细胞定向诱导分化的条件及方法,以明确其神经分化潜能。方法:将人脐血间充质干细胞体外培养扩增、保存后,取第5代的MSCs分别用维甲酸(RA)、维甲酸联合神经生长因子(NGF)诱导方法向神经样细胞诱导,诱导分化期间观察细胞形态变化,并比较表达神经元特异性烯醇化酶(NES)mRNA、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)mRNA的差异。结果:两种不同诱导方法均能诱导细胞发生典型变化,对照组未发现神经样细胞生长。免疫组化法显示三种诱导方法诱导后均表达Nestin、NSE、GFAP,NGF+RA组多于RA组。Real-time RT-PCR显示诱导组及对照组均有NSE mRNA、GFAP mRNA表达,但两种诱导方法诱导后表达上调(P<0.05),添加NGF较单纯RA组上调明显(P<0.05)。结论:脐血MSCs经两种神经营养因子诱导法均可分化为神经样细胞,并表达神经细胞特异性标志物,其中添加NGF后较单纯应用RA诱导效果好。     

小凹蛋白-1在大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的作用

目的 应用RNA干扰(RNA interference)技术,抑制沉默小凹蛋白-1(caveolin-1)基因的表达,观察小凹蛋白-1在骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法 构建大鼠caveolin-1 siRNA(small interfering RNA),然后传染大鼠MSCs,诱导分化并在倒置显微镜下进行形态学观察,用MTT比色法检测细胞存活率,采用免疫细胞化学染色法检测Nestin、 NSE(神经元标记物) 、GFAP(神经胶质细胞标记物)的表达,设诱导未传染组和传染对照组作为对照研究.结果 用caveolin-1 siRNA传染MSCs后,caveolin-1基因表达消失,传染后24 h和3 d MSCs细胞存活率下降,与诱导未传染组和传染对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),传染caveolin-1 siRNA的MSCs向神经元样细胞分化效率显著提高,诱导24 h后NSE阳性细胞率为(75.5±2.5)%,6 d后达(81.6±3.5)%,且未见GFAP的表达,与诱导未传染组和传染对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 caveolin-1 siRNA抑制caveolin-1基因的表达,可提高MSCs向神经元样细胞的分化效率. Abstract： Objective To investigate the role of caveolin-1 in bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) differentiating into neuron-like cells by transfecting MSCs with small interfering RNA(siRNA). Methods Construct caveolin-1 siRNA and then transfect into MSCs cultured in vitro. Cell growth was observed by an inverted phase contrast microscope. The survival ratio of MSCs was determined by MTT before transfection,24 hour, 3 days after transfection,respectively. MSCs was induced to differentiate into neuron-like cells by-ME. The neural cell specific marker Nestin,NSE,GFAP were determined by immunocytochemistry stain technique. Results Expresion of caveolin-1 vanished by tranfection of caveolin-1 siRNA,survival ratio of MSCs by transfection decreased and there was significant differences between no-transfection and transfection-controlling group after 24 hours and 3 days of transfection(P<0.01).The differentiation efficiency of MSCs transfected by caveolin-1 siRNA into neuron-like cells and the expression of NSE were increased significantly than no-transfection and transfection-controlling group, The percentage of positive NSE was(75.5±2.5)% after 24 hours and(81.6±3.5)% after 6 days, there was no expression of GFAP. There was significant differences between no-transfection and transfection-controlling group(P<0.01). Conclusions The differentiation efficiency of MSCs increased by suppressing caveolin-1 expression.     

三磷酸胞苷二钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的 探讨三磷酸胞苷二钠(CTP)诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法 取成年SD大鼠,用贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞(BMSCs),传代扩增,连续观察细胞形态及生长特性.用不同浓度(0.05、0.10、0.20、0.40和0.80 mg/mL)CTP对BMSCs进行诱导;诱导后用免疫组织化学检测细胞神经微丝蛋白(NF)、胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元烯醇化酶(NSE)的表达.计算阳性细胞比例,进行统计学分析,选出合适的诱导剂量.结果 随CTP浓度增高,经免疫组织化学检测NF、GFAP和NSE阳性细胞比例也呈现逐步增高趋势,到一定浓度后又有所下降,统计学分析,CTP浓度为02 mg/mL时,能够诱导NF、GFAP和NSE阳性细胞比例为(32.73±0.63)%、(62.77±2.45)%和(30.41±0.65)%,显著高于对照组(P＜0.01).结论 CTP是一种很好的体外诱导剂,可以诱导MSCs向神经细胞分化,以0.2 mg/mL CTP作诱导剂,能够获得较明显的诱导MSCs向神经细胞和神经胶质细胞分化的结果.     

β-巯基乙醇和脑匀浆上清对骨髓间充质干细胞的神经诱导作用

目的探讨β-巯基乙醇(BME)和大鼠脑匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为类神经元样细胞的作用。方法采用全骨髓培养法从SD大鼠骨髓中分离培养MSCs,经贴壁法体外扩增、传代和流式细胞仪鉴定。①以1mmol/L浓度BME的含血清DMEM培养基预诱导24 h,再以含5 mmol/L BME的无血清DMEM培养基诱导5 h至MSCs神经分化。②使用大鼠脑匀浆上清诱导MSCs,48 h至神经分化。免疫细胞化学染色分别检测两种诱导方法MSCs培养物神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果第5代MSCs有97.5%表达CD90抗原,1.72%表达CD45抗原。两种方法诱导后的细胞均具有神经细胞的形态特征;相比脑匀浆上清BME诱导组细胞形态变化更快。两种方法都可诱导MSCs表达NSE;鼠脑匀浆上清可诱导MSCs表达GFAP。结论MSCs具有向神经细胞分化的可塑性,相比BME,鼠脑匀浆上清具有诱导MSCs向胶质细胞分化的倾向。     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

成年大鼠骨骼肌肌源性干细胞向神经细胞的分化

目的 研究成体骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向神经细胞分化的潜能.方法 从成年 SD 大鼠骨骼肌组织中培养出肌源性干细胞,采用 bFGF、EGF 诱导出神经球样细胞团,并检测 nestin 表达.再在贴壁培养条件下,用 RA、BDGF 诱导分化,并检测 NSE、GFAP 的表达.结果 MDSCs 能被诱导出神经球样细胞团,并表达 nestin.这些细胞进一步诱导,部分细胞表现出神经元样或胶质细胞样形态,并表达 NSE 或 GFAP.结论 MDSCs 能向神经细胞样细胞分化,有望用于神经系统疾病的治疗.     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的逆转化现象

目的 研究成人骨髓问充质干细胞(hMSC)分化为神经元样细胞后的逆转化现象。方法 从成人骨髓分离、培养和扩增hMSC。用参芪液诱导hMSC分化为神经元样细胞，并用免疫组化方法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。采用RT-PCR方法检测10个基因(内胚层基因ceruloplasmin；中胚层基因SM22；外胚层基因Amyloid precursor protein,syntaxin；生殖系基因protamine；神经元特异性基因Neuro D、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化为神经元样细胞的动态变化以及逆转化细胞的基因表达变化。结果 hMSC经参芪液诱导后，可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性，GFAP阴性。去除参芪液，观察到神经元样细胞又恢复为hMSC的外形，呈现宽大扁平或长梭形。基因检测显示逆转化的细胞基因表达与未分化hMSC相似。结论 参芪液可以促进hMSC分化为神经元样细胞，诱导分化过程可以出现逆转化现象。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的逆转化现象

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(hMSC)分化为神经元样细胞后的逆转化现象.方法 从成人骨髓分离、培养和扩增hMSC.用参芪液诱导hMSC分化为神经元样细胞,并用免疫组化方法鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.采用RT-PCR方法检测10个基因(内胚层基因ceruloplasmin;中胚层基因SM22:外胚层基因Amyloid precursor protein、syntaxin;生殖系基因protamine;神经元特异性基因Neuro D、NF、NSE、GFAP、Tau)在诱导分化为神经元样细胞的动态变化以及逆转化细胞的基因表达变化.结果 hMSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞.免疫组化显示诱导出的神经元样细胞表达NSE、NF阳性,GFAP阴性.去除参芪液,观察到神经元样细胞又恢复为hMSC的外形,呈现宽大扁平或长梭形.基因检测显示逆转化的细胞基因表达与未分化hMSC相似.结论 参芪液可以促进hMSC分化为神经元样细胞,诱导分化过程可以出现逆转化现象.     

转染脑源性神经营养因子的骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑缺血损伤的实验研究

目的： 探讨移植转染脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在宿主脑缺血区的基因表达情况,以及对神经损伤的修复作用。方法： 将pcDNA 3.1-BDNF转染到大鼠MSCs中,并检测其表达情况。建立大鼠大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,并将大鼠随机分成对照组、PBS移植组、MSCs移植组和转基因MSCs移植组,每组均8只。将PBS悬液、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记的MSCs悬液、BrdU标记的转基因MSCs悬液分别移植到PBS移植组,MSCs移植组和转基因MSCs移植组大鼠的纹状体缺血区半暗带,对照组不移植。移植后1～30 d对各组大鼠进行神经损害严重程度评分(neurological severity score, NSS)并相互比较。移植后30 d,检测各组大鼠脑缺血区BDNF、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolasw,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达情况。结果： 大鼠脑缺血区移植转基因MSCs 24 h后,检测到BDNF的表达。移植后1 d各组NSS评分无显著差异,移植后7、14、21、30 d均显示转基因MSCs移植组低于其他组。移植后30 d, 转基因MSCs组BDNF阳性细胞数较MSCs组明显增多;NSE、GFAP阳性细胞数较其他组显著增多。结论： 大鼠脑缺血区移植转基因MSCs后表达基因产物,同时其表达的NSE、GFAP蛋白增加,对宿主的神经损伤具有修复作用。转染BDNF基因的MSCs移植是治疗脑缺血性疾病的可行途径。     

定向诱导兔骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 :体外定向诱导兔骨髓间质干细胞 (MSC)分化为神经元样细胞。方法 :采用Ficoll Paque液 (1 .0 83g/L)离心分离兔MSC ,体外扩增 ,硫代甘油等试剂的无血清达乐伯克改良必需基本培养基 (DMEM)诱导MSC分化为神经元。免疫组化鉴定神经元烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果 :兔骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得 5× 1 0 5、1 0代可获得 2× 1 0 1 0 个细胞。加入硫代甘油诱导后 ,MSC胞体收缩 ,突起伸出 ;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF、表达阳性 ,GFAP阴性。结论 :兔骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外黄芪诱导分化为神经元样细胞.方法 通过密度梯度离心从大鼠骨髓中分离有核细胞进行培养,观察细胞的形态和生长情况,分离纯化,传代扩增.采用含黄芪的无血清L-DMEM诱导分化为神经元样细胞,观察细胞形态变化,以免疫组织化学染色方法检测分化细胞中巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.用RT-PCR方法半定量分析相关基因neurogenin-1(Ngn-1)和Wnt-1基因在诱导过程中的表达.结果 经传代后,骨髓间充质干细胞呈纤维细胞样,有较强的增殖能力.经黄芪诱导后,细胞形态发生改变,nestin、NSE和GFAP表达阳性,分化为神经元或胶质细胞样细胞.Ngn-1和Wnt-1基因在黄芪诱导后明显上调.结论 大鼠骨髓间充质干细胞可以体外分离、培养,并在黄芪诱导下向神经元样细胞分化.Ngn-1和Wnt-1基因在其分化过程中起正调控作用.     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用，为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法体外培养MSCs至第5代后，分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs，诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数，对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较；诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态；BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长；BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰，而β-ME在诱导2h即达高峰，但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性；RT-PCR显示NSE、NFL，MAP-2的mRNA表达阳性，GFAP有较弱的表达；蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞．而且分化后细胞的存活时间长．有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

地黄多糖在诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化过程中对Notch1蛋白表达的影响

目的探讨地黄多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经样细胞的作用,及其对Notch1蛋白表达的影响。方法以大鼠BMSCs为研究对象,取第3代细胞,分为对照组、β-巯基乙醇诱导组(5mmol/L BME)和地黄多糖诱导组(0.2 mg/mL)进行诱导实验,应用流式细胞仪检测诱导前后细胞生长周期改变情况,免疫细胞化学染色法检测神经标志物:神经巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Notch1蛋白的表达,Western blot检测Notch蛋白胞内片段(NICD)的表达情况。结果流式细胞仪检测示地黄多糖诱导后G0/G1期细胞比例明显升高,而S+G2/M期的细胞比例明显下降。免疫细胞化学染色显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后产生特异性神经细胞标志物表达。其中地黄多糖组nestin及NSE阳性细胞率高于β-巯基乙醇诱导组(P<0.05);GFAP阳性细胞率低于β-巯基乙醇诱导组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示地黄多糖诱导组诱导前为Notch1蛋白强阳性或阳性染色,并随诱导时间延长阳性细胞逐渐减少。Western blot结果显示地黄多糖诱导组诱导分化24 h后细胞内NICD含量逐渐下降,到第5天时,低于诱导前水平,且仍明显低于对照组。结论地黄多糖可能通过抑制Notch1蛋白表达而诱导BMSCs向神经样细胞分化,且主要向神经元样细胞方向分化。