携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建尾型同源盒基因-2(CDX2)基因的慢病毒表达载体并进行鉴定。方法 PCR扩增CDX2基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pWPI,通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染包装细胞293T后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染直肠癌细胞XB1847,经PCR和Western Blot证明重组慢病毒携带的CDX2在XB1847细胞内表达的情况。结果经PCR扩增、酶切及测序验证,重组质粒构建成功,命名为pWPI-CDX2。PCR和Western Blot证明重组慢病毒感染XB1847细胞后CDX2能稳定表达。结论成功构建了携带CDX2的慢病毒载体,为研究CDX2在直肠癌中的功能提供了实验基础。     

WWOX基因慢病毒载体的构建及其在卵巢癌细胞中的表达

目的：构建及鉴定WWOX基因慢病毒载体,观察WWOX基因在人卵巢癌PEO1细胞株中的表达,为进一步研究WWOX基因的作用机制及其功能奠定基础。方法：采用PCR技术从克隆质粒模板中获得全长WWOX基因,将WWOX基因亚克隆到慢病毒载体PCDH—CMV—MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX,通过双酶切验证后,慢病毒表达质粒与慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG,pPACKH1-REV,Pvsv-G共转染293T细胞,获得携带WWOX基因及EGFP基因的重组慢病毒Lenti WWOX,并转染靶细胞人卵巢癌PEO1细胞株。通过RT—PCR和Western Blot验证Lenti WWOX在PEO1细胞株中的表达。结果：测序结果显示成功构建重组慢病毒载体表达质粒PCDH—WWOX;表达质粒与辅助包装质粒共转染包装细胞293T后能产生慢病毒颗粒并能有效感染靶细胞PEO1,转导效率约为60％,有WWOX基因mRNA和蛋白水平的高表达。结论：本实验成功构建了携带WWOX基因慢病毒表达载体,包装成病毒后能有效感染卵巢癌PEO1细胞。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况.方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入peDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,Westem blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白.结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础.     

抗CD40单链抗体的慢病毒载体的构建和表达

目的克隆大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体（CD40-scFv）,并构建可表达大鼠抗小鼠的抗CD40抗体的单链抗体（CD40-scFv）的重组慢病毒。方法采用RT-PCR法从分泌大鼠抗小鼠抗CD40激活型抗体的杂交瘤细胞株（FGK-115）中克隆VH和V1基因,用重叠延伸PCR法将V。和V。拼接在一起,构建抗CD40抗体的scFv基因,将CD40-scFv基因连接至PEGM-T克隆载体,限制性内切酶酶切及测序鉴定;构建含有大鼠抗小鼠的抗CIM0激活型抗体的单链抗体（CD40-scFv）的慢病毒穿梭质粒,并与其它包装质粒一起通过磷酸钙法感染293T细胞;获得病毒颗粒并感染人慢性髓系白血病细胞MEG-01,检测其感染效率。结果含大鼠抗小鼠的抗CIM0激活型抗体的单链抗体（CD40-scFv）的慢病毒穿梭质粒构建成功;通过磷酸钙感染293T细胞所得病毒上清可成功感染MEG-01细胞,流式细胞术检测阳性率可达96％。结论成功克隆了大鼠抗小鼠的抗CD40激活型抗体的单链抗体（CD40-scFv）基因,并建立其重组慢病毒表达系统,为后续的实验及应用研究工作奠定了基础。     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

NOD小鼠CD8α+抗原基因克隆载体的构建及其相关蛋白在树突状细胞中的表达

目的：构建NOD小鼠CD8α⁺抗原基因重组慢病毒载体,探讨其在树突状细胞（DCs）中的表达,阐明1型糖尿病（T1DM）的发病机理。方法：设计CD8α+基因特异性引物,从NOD小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增CD8α⁺基因,与质粒载体pCDF1-MCS2-EF1-COPGFP进行连接重组,经过转化、筛选、鉴定和序列测定后,应用Western blotting法检测CD8α⁺基因的表达。应用Nanofectin脂质体转染试剂将含有目的基因的质粒转染HEK293细胞,进行重组慢病毒载体包装,将包装后的重组慢病毒颗粒感染DCs,采用Western blotting法检测CD8α⁺蛋白的表达。结果：成功构建了NOD小鼠CD8α⁺抗原基因的重组质粒载体,重组表达载体经转染HEK293细胞获得了重组病毒的原液,重组病毒扩增后感染DCs,免疫荧光下可见DCs内含有绿色荧光蛋白(GFP)表达。结论：NOD小鼠CD8α⁺抗原基因重组病毒载体构建成功,且有相关蛋白表达。
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人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

人表皮生长因子慢病毒载体的构建及表达

目的:构建人表皮生长因子(hEGF)慢病毒(LV)载体.方法:酶切并收集pcDNA 3.1-hEGF载体中的hEGF目的基因片段,克隆进入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体内,将所得重组体LV-GFP-hEGF与辅助载体pA8.2和pVSVG共同转染人胚肾293T细胞,进行病毒包装.收集上清液,按按10-1～10-7倍比稀释后培养,检测病毒滴度;裂解细胞,进行Western Blot分析.结果:PCR扩增、HindⅢ酶切鉴定及测序结果均证实LV-GFP-hEGF构建成功.将LV-GFP-hEGF转染293T细胞,紫外光下检测可见绿色荧光;LV滴度达5×108TU/mL,转染效率＞75%,Western Blot证实转染细胞町表达hEGF.结论:成功构建了含有GFP报告基因的hEGF慢病毒载体,包装后的慢病毒可在293T细胞内高效表达.     

小鼠雌激素受体α基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建C57BL/6小鼠雌激素受体α（Esr1）重组腺病毒表达载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞扩增目的Esr1 CDS区基因片段,至pMD19-TSimple载体后测序鉴定.亚克隆Esr1CDS区基因片段至腺病毒穿梭质粒pDNR-CMV,再与骨架质粒pLP-Adeno-X-CMV在感受态大肠杆菌ElectroMAXTMDH10BTMCells中进行同源重组获得腺病毒载体质粒Adeno-Esr1,PacI酶切线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,测定感染性滴度,获得重组腺病毒Ad-Esr1.将病毒感染HEK293细胞,Western Blot检测Esr1蛋白表达.结果：测序证实提取的Esr1 CDS区基因序列完全正确;测序及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;感染性滴度为6.4×1013（pfu/L）,Western Blot检测Ad-Esr1感染的HEK293细胞能表达Esr1蛋白,而未感染的HEK293细胞蛋白不表达.结论：成功构建了C57BL/6小鼠Esr1基因重组腺病毒载体,为进一步研究Esr1在神经系统中生物学功能及对神经系统疾病的基因治疗奠定了基础.     

核心结合因子α1过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建含人CBFα1/RUNX2基因的过表达慢病毒载体。方法采用PCR技术体外扩增人CBFα1/RUNX2,将扩增产物与慢病毒载体pGC-FU连接,构建重组质粒pGC-FU-hCBFα1/RUNX2,并进行酶切及测序鉴定。鉴定正确的克隆转染293T细胞,经荧光显微镜观察和Western Blot检测hCBFα1/RUNX2基因在293T细胞内的瞬时表达。再利用脂质体转染法将pGC-FU-hCBFα1/RUNX2、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR检测病毒滴度。结果重组质粒经测序证实,插入片段与人CBFα1/RUNX2基因序列完全一致。荧光显微镜观察以及Western Blot印迹均证实pGC-FU-hCBFα1/RUNX2中携有正确的hCBFα1/RUNX2基因,并能在293T细胞中瞬时表达。包装慢病毒后实时荧光定量PCR检测病毒滴度为(2.00×108)TU/mL。结论成功构建了携带hCBFα1/RUNX2基因的重组慢病毒载体,为进一步研究其在牙周组织再生中的生物学功能奠定了基础。     

CVB3-VP1基因与IL-15双表达质粒的构建

目的构建IL-15/CVB3-VP1的基因双表达重组质粒。方法从人胚肺二倍体细胞中提取IL-15的mR-NA,逆转录后将产物与pGEM-Teasy载体连接,转化DH5a大肠杆菌,筛选重组子并提取质粒进行酶切鉴定和测序。取双酶切的目的基因片断,与经过同样两种酶切的pcDNA3载体连接,经过转化、筛选和酶切鉴定后,构建成真核表达重组质粒PcDNA3-IL-15。用自行设计的引物从PcDNA3-VP1质粒上扩增出带有启动子的VP1基因,插入到PcDNA3-IL-15质粒上,构建成真核重组质粒PcDNA3-IL-15/CVB3-VP1。结果构建的PcDNA3-VP1/IL-15重组质粒目的基因与CVB3-VP1和IL-15的标准序列相同。结论成功构建了柯萨奇病毒VP1基因和人白细胞介素15基因双表达质粒PcDNA3-IL-15/CVB3-VP1。     

人IL-21cDNA的克隆及重组腺病毒表达载体的构建

目的：构建含人IL-21基因的重组腺病毒表达载体,为IL-21基因治疗肿瘤研究奠定基础。方法：从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,将其连接到进入载体pENTR1A,然后经LR重组转入到腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST中,构建含IL-21基因的腺病毒载体（Ad-IL-21）,并进行测序鉴定和PCR鉴定。结果：Ad-IL-21表达载体测序结果与GenBank中IL-21基因序列一致,Ad-IL-21经PCR扩增出IL-21基因片段。结论：成功构建携带人IL-21基因的重组腺病毒表达载体。     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

人白细胞介素-16真核表达载体的构建及其对Th2型肿瘤细胞的促逆转作用

构建人IL-16真核表达载体,分析其对Th2型肿瘤细胞的逆转作用。方法用RT- PCR技术从人外周血单个核细胞中获取IL-16cDNA,插入PUC-18T载体并测序,构建并鉴定真核表达载体PcDNA3-IL-16,转染KarpasT淋巴瘤细胞,分析阳性克隆中IFNγ,IL-2,IL-4,IL-6,IL-13,TNFα和IL-16等细胞因子的表达状况。结果序列测定显示所克隆的人IL-16cDNA与基因库中所登录的序列完全一致,EcoRI和BamHI双酶切及PCR鉴定显示所构建的真核表达载体PcDNA3-IL-16完全正确,RT-PCR显示转染PcDNA3-IL-16的KarpasT淋巴瘤细胞高表达IL-16mRNA,同时,Th1类细胞因子IFNγ表达明显增高,Th2类细胞因子IL-4,IL-6,IL-13表达降低,MTT法显示KarpasT淋巴瘤细胞的增殖受到明显抑制。结论成功构建了真核表达载体PcDNA3-IL16,转染KarpasT淋巴瘤细胞后使其细胞因子类型由Th2型向Th0型逆转,且生长受到明显抑制,表明向肿瘤细胞转染人IL-16是一种有用的肿瘤生物治疗方法。     

重组缓释白介素4的克隆表达与鉴定

目的 重组表达可以缓释的抗炎因子白介素4（Interleukin 4,IL-4）。方法 根据小鼠IL-4的氨基酸序列,并基于大肠杆菌密码子偏爱性合成IL-4的基因,通过聚合酶链式反应(PCR)方法将胶原蛋白结合域(collagen binding domain, CBD)的编码序列和组氨酸标签序列连接到IL-4基因上,运用无缝克隆技术将上述重组基因插入pET-30a(+)载体。重组蛋白通过组氨酸标签进行纯化,纯化的蛋白被用于诱导M0巨噬细胞分化成M2巨噬细胞,同时检测M2巨噬细胞相关基因表达以及对白介素10（Interleukin 10, IL10）的分泌。与Ⅰ型胶原蛋白的联用验证胶原蛋白对重组因子的吸附和缓释功能。结果 带有CBD序列和组氨酸纯化标签的IL-4通过镍柱纯化,具有与商业化IL-4相似的生物活性。功能实验证实其能够被胶原蛋白吸附,并能脱离胶原蛋白缓释。结论 通过大肠杆菌表达纯化获得了能够缓释的抗炎因子IL-4.     

真核表达质粒pBK—IL—1ra的构建及表达

目的 构建可在真核细胞内高效表达白细胞介素－１受体拮抗剂（ＩＬ－１ｒａ）的真核表达质粒ｐＢＫ－ＩＬ－１ｒａ,以便用于ＩＬ－１ｒａ基因治疗研究。方法 采用分子生物学技术将ＩＬ－１ｒａ ｃＤＮＡ插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ中,构建成真核表达质粒ｐＢＫ－ＩＬ－１ｒａ。通过竞争性ＥＬＩＳＡ、原位杂交和免疫组检测其在体外和体内转染真核细胞后ＩＬ－１ｒａ基因和蛋白的表达。结果 （１）酶切、ＰＣＲ和ＤＮＡ测序     

白细胞介素—6相关新基因的生物学分析

目的：通过白细胞介素－6（IL－6）相关新基因的生物学分析，研究IL－6的作用机制。方法：利用IL－6相关表达序列标签（EST）进行电子克隆获得924bp全长新基因，后采用RT－PCR方法从IL－6激活的人U937细胞所提的总RNA中钓取，此片断连到pGEM-Teasy质粒上并测序。结果：成功钓取了IL－6相关EST电子克隆的全长cDNA基因。结论：使用电子克隆技术对于发现新基因有重要的指导意义。     

H5N1亚型禽流感病毒ns1基因修饰

目的：对HSN1亚型禽流感病毒株(A/Qa／ST/852/01)的ns1基因进行修饰并构建ns1基因的真核表达载体。方法：用RT-PCR方法扩增A/Qa／ST／852／01的ns1基因。之后以扩增产物为模板，采用多重PCR技术对ns1基因进行修饰，将缺失的15个核苷酸片段插入ns1基因中，并将其克隆到真核表达载体，构建pcDNA3．1/ns1重组质粒。结果：RT-PCR产物测序显示，A/Qa／ST／852／01 ns1基因开放阅读框全长678bp，编码225个氨基酸。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列测定与预期相一致。结论：成功将缺失的15个核苷酸片段引入A/Qa／ST／852／01的ns1基因中，重组质粒的构建为NS1蛋白功能研究奠定了基础。     

人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的高效稳定表达

目的　在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中表达人白细胞介素１５（ＩＬ１５）,为ＩＬ１５ 的功能研究提供有利条件。方法　采用ＰＣＲ技术扩增人ＩＬ１５ 编码区ｃＤＮＡ片段,构建重组真核表达载体,再以脂质体法转染至ＣＨＯ 细胞进行表达,鉴定表达产物的生物学活性。结果　共获得８ 株高效表达ＩＬ１５ 的阳性克隆,其平均活性为（３１８５４±３２７２）Ｕ／（１０６ ｃｅｌｌｓ·ｄ）,稳定传代６ 个月后仍保持其表达活性。结论　人ＩＬ１５ ｃＤＮＡ在ＣＨＯ细胞中获得高效稳定表达     

人重组白细胞介素11在毕氏酵母系统中的表达及纯化

目的在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达人白细胞介素-11(rhIL-11),便于进一步开发。方法以人工设计合成的rhIL-11基因,构建表达载体pPICZαA-IL-11,经线性化后电转化导入毕氏酵母菌株KM71,甲醇诱导表达,用ELISA和SDS-PAGE检测发酵上清中IL-11的抗原性和表达量,用IL-11依赖的B9-11细胞株分析其生物学活性,采用疏水层析、离子交换和凝胶过滤纯化发酵上清中的IL-11。结果序列分析表明,克隆载体中IL-11人工基因序列与设计相符;基因工程菌株KM71-2424在摇瓶培养上清中IL-11的表达量超过60mg/L,生物学活性测定显示其比活性为5.5×10