人BAFF cDNA的克隆及原核表达载体的构建

目的 克隆人BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family)全长及128－285片段的cDNA并构建其原核表达载体，为表达和检测其生物学活性做准备。方法 提取HL－60细胞总RNA，经RT－PCR扩增编码人BAFF全长及128－285氨基酸残基的cDNA序列，并将其克隆至载体pUC18和pUC19进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT－PCR扩增得到了858bp和477bp的DNA片段，序列分析与GenBank中报道的编码BAFF全长及128－285氨基酸残基的cDNA序列完全一致。结论 BAFF cDNA的克隆及其原核表达载体的构建，为进一步表达和检测其生物学活性奠定了基础。     

人可溶性TRAIL cDNA的克隆及新型原核表达载体的构建

目的 克隆人可溶性TRAIL（sTRAIL)cDNA并构建其原核表达载体，为制备新型抗癌分子创造条件。方法 提取HL－60细胞总RNA，经RT－PCR扩增编码人TRAIL114－281氨基酸残基的cDNA序列，将其克隆至pUC19进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT－PCR扩增得到了504bp的DNA片段，序列分析表明与GeneBank中报道的编码人TRAIL 114－281氨基酸残基的cDNA序列安全一致。结论 sTRAIL cDNA的克隆及其原核表达载体的构建，为进一步制备具有抗肿瘤活性的sTRAIL奠定了基础。     

Eotaxin原核表达载体的构建及初步表达

目的：获得人嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin基因，构建其原核表达载体，并初步表达成熟的Eotaxin，为进一步构建其N-端突变体，检测其生物学活性作准备。方法：提取外周血单个核细胞细胞总RNA，经RT-PCR扩增编码人Eotaxin全长cDNA序列，并将其克隆至T载体进行序列测定，然后构建于原核表达载体pET30a^＋中，并转入大肠杆菌表达。结果：RT-PCR扩增得到了400bp左右的DNA片段，序列分析发现其中包含了GenBank中报道的编码EotaxincDNA序列，并获得了正确表达。结论：EotaxincDNA的克隆及其原核表达载体的构建及表达，为进一步构建其N-端突变体，纯化和检测其生物学活性奠定了基础。     

人CD137分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的：克隆人CD17分子的编码序列，将其重组人真核表达载体，并表达于COS－7细胞，方法：从活化的T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人CD137的编码序列，对其序列进行测定。将测定正确的CD137编码序列克隆入真核表达载体PCI－neo，构建重组表达载体。采用质体法转染COS－7细胞，用流式细胞仪检测CD137分子的表达。结果：PCR方法扩增出一800bp左右的基因片段，插入PCI－neo构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为人CD137编码序列，将重组子转染COS－7细胞，流式细胞仪检测显示有27．11％的细胞表达人CD137分子。结论：成功地克隆并在COS－7细胞中表达了CD137分子。     

一个新的C2H2型锌指蛋白cDNA基因的克隆

目的：从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因片段。方法：提取K562细胞中总RNA,逆转录后,用CX2C和H－C Link引物进行加端PCR,扩增产物经限制性内切酶酶切后,重组至pGEMTZf( )载体,用末端终止法测定插入片段的序列。结果：测出五个插入片段的序列。与GenBank核酸数据库中的已知序列进行同源性比较分析,发现一个序列为新的cDNA基因片段。该基因编码产物至少含有五个C2H2型锌指结构。结论：从K562细胞中克隆出一个新的C2H2型锌指蛋白cDNA基因片段,为测定该基因的全序列和功能研究奠定了基础。     

表达序列标签分析在血吸虫基因组研究中的应用

表达序列标签分析是借助于100－400个核苷酸长度的标记引物，在随机选取cDNA克隆，进行5′端或（和）3′端进行大规模一次性测序，将得到的片段与数据本就EST分析在血吸虫基因组研究中的应用进行综述。     

从Hep-2细胞克隆hVEGF165/VEGF121基因及序列分析

目的 从Hep-2(喉鳞癌细胞)克隆hVEGF165、hVEGF121cDNA并重组到克隆载体中，用于下一步构建表达VEGF165、VEGF121的腺病毒载体。方法 设计和合成引物，提取Hep-2细胞的总mRNA，进行逆转录～聚合酶链反应(RT-PCR)，扩增出两个目的cDNA，并将其重组到pGEM-T Easy载体中送测序。结果 从Hep-2细胞的总mRNA中反转录扩增得到588bp和456bp的片段，经重组送测序证实两基因分别与GenBank中的［GI：19909064]及[GI：6631028]提供序列完全一致。结论 从Hep-2细胞我们成功获得VEGF165、VEGF121的cDNA并构建其克隆载体可供进一步研究。     

大鼠共刺激分子B7 cDNA的克隆和骨肉瘤细胞转染

目的：为了研究共测激分子B7增强针对大鼠骨肉瘤的特异性细胞免疫反应，首先需获得大鼠B7分子的cDNA克隆，方法：应用反转录PCR的方法，从大鼠脾细胞mRNA中扩增特异性片段，结果：经测序表明，所获得的cDNA克隆与已经发表的B7－1和B7－2的c-DNA序列完全一致，并将其表达载体转染UMR－106细胞系，结论：成功获得大鼠B7共刺激分子的cDNA克隆，其转染的UMR－106大鼠骨肉瘤细胞可用于免疫诱导研究。     

人TRAIL分子胞外区的克隆及新型表达载体的构建

目的：利用基因工程技术克隆人TRAIL分子胞外区41－281片断的cDNA，构建其原核表达载体，从而建立原核表达体系。方法：采用RT－PCR方法从人早幼粒白血病细胞系HL－60的总RNA中扩增TRAIL分子41－281片断的cDNA，以限制性酶切和DNA测序进行鉴定，并将目的片断克隆至原核表达载体pQE-80L。结果：克隆到人TRAIL分子41－281片断的cDNA,DNA测序结果与报道的完全一致；构建了该片断的原核表达载体，为后续基因工程研究打下了基础。结论：成功克隆人TRALL分子41－281片断的cDNA并构建了其原核表达载体。     

人THANK基因的克隆和表达

目的：克隆人THANK基因全长及胞外区片段，将其胞外区在大肠杆菌中表达。方法：采用RT－PCR技术，从人白血病细胞系HL－60细胞总RNA中扩增人THANKcDNA，并定向克隆于pMD18－T载体，经测序证实，再业克隆THANK的胞外区片段至pET表达载体，在大肠杆菌中进行表达。结果：RT－PCR扩增出一个858bp的DNA片段，该片段与分布的人THANK基因序列一致。诱导后THANK胞外区在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为2．6万的蛋白质。结论：成功地克隆了人THANK基因，并在大肠杆菌中获得表达，为其功能的研究打下基础。     

人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.     

凋亡相关蛋白Apr-2的克隆、测序及初步表达

目的: 从HL-60细胞凋亡模型中克隆凋亡相关蛋白Apr-2编码区基因,并对其进行表达,为进一步研究Apr-2的结构功能及多克隆抗体的制备奠定基础.方法: 建立HL-60细胞凋亡模型,提取HL-60凋亡细胞总RNA,以RT-PCR方法获取Apr-2 cDNA编码区全序列,将其与PGEM-T Easy载体连接,转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体PGEM-TEasy/apr-2,测序正确后,将目的片段亚克隆入PGEX-4T-2原核表达载体,并转化大肠杆菌, IPTG诱导重组蛋白质表达,分析蛋白质在细菌中的表达分布,进行凝胶自动扫描分析. 结果:序列分析表明,与GenBank中已登录的Apr-2 cDNA编码区序列比较,完全一致.表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的40%以上,主要以包涵体的形式存在. 结论:成功的获得了细胞凋亡模型HL-60中Apr-2 cDNA编码区的克隆及其融合蛋白表达产物.     

人促血小板生成素(TPO)原核表达载体pQE30-TPO的构建

目的：获得人血小板生成素全长cDNA克隆，并构建重组表达载体pQE30-TPO。方法：利用RTPCR技术从人胎肝细胞mRNA中扩增目的基因，将扩增产物克隆至pMD18-T载体，经菌落PCR鉴定后，DNA序列分析重组质粒pMD18－T－TPO。构建并鉴定原核表达载体pQE30-TPO。结果：构建了重组克隆载体pMD18-T-TPO和重组表达载体pQE30-TPO，序列分析表明，获得的TPO cDNA序列与国内外报道的人促血小板生成素核苷酸序列完全一致。结论：成功构建了重组表达载体pQE30-TPO，为TPO的进一步研究奠定了基础。     

人MUC-1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的 构建含人MUC－1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察其在COS－7细胞中的表达。方法 将目的基因MUC－1克隆入pGEM-3zf(-)载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pcDNA3.1( )，构建真核表达载体pcDNA3.1( )-MUC-1。用电穿孔法将重组质粒转入COS－7细胞，以免疫荧光和流式细胞仪检测MUC－1的表达。结果 酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人MUC－1全长cDNA编码序列，转染实验表明MUC－1基因能在COS－7细胞中表达。结论 人MUC－1全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS－7中的表达均获成功，为基因疫苗的进一步研究奠定了基础。     

表皮生长因子受体跨膜区编码序列的克隆

目的：克隆表皮生长因子受体跨膜区（Transmembrane,TM）编码序列，为构建跨膜型超抗原和细胞因子的表达载体奠定基础。方法：以表达c-erb-B2癌基因的中国卵巢癌细胞系HO－8910细胞的RNA逆转录产物(cDNA）为模板，用两条针对c-erb-B2全长基因序列中编码TM区序列特异性的引物，采用RT－PCR方法克隆TM区片段并测序。结果：实验克隆的TM编码序列，经测序证实与Genbank中接受号为M11730的TM区序列完全一致；与接受号为X03363的TM区序列存在G→A的多态性。结论：成功地克隆了TM编码序列，并证实源于中国的卵巢癌细胞系HO－8910中所包含的表皮生长因子受体基因中编码的TM区序列存在多态性。     

一个表达序列标签的克隆——应用限制性显示技术

目的：应用限制性显示PCR（resriction display polymerase chain reaction,RD-PCR)技术分离克隆SH－SY5Y细胞的基因片段。方法：从SH－SY5Y细胞中分离提纯mRNA，然后以Oligo(dT18)为锚定引物反转录生成单链cDNA，再以此为模板合成DNA的第二条链；将双链DNA经Sau3AI酶切之后，接上接头，经通用引物和选择性引物扩增后，与载体pMD18相连，克隆，测序。结果：分离出一段cDNA,经Blast分析，发现与基因组17号染色体的一段序列具有高度的相似性，运用GenScan分析这段DNA序列，提示这段表达序列标签（expressed sequence tag,EST)可能是一个未知基因的一部分。结论：RD－PCR技术是一种简便，有效的分离克隆基因片段的方法，运用生物信息学对EST的染色体定位以及下一步的实验可能具有一定的指导意义。     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

人类免疫共刺激信号B7-2分子逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建含B7－2基因片段的克隆载体pGEM-B7-2和表达载体pLSN-B7-2。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）方法从人类慢性淋巴细胞白血病Raji细胞株中扩增到人B7－2cDNA基因片段，并经回收纯化酶切后，分别连接到质粒pGEM-Teasy和pLXSN上。结果：琼脂糖凝胶电泳及序列测定证实，扩增的B7－2cDNA片段的碱基组成与Genebank提供的人B7－2cDNA的基因组成相同。结论：酶切证实成功构建得了克隆载体pGEM-B7-2和表达载体pLSN-B7-2,为将B7－2基因转导到肿瘤细胞制备肿瘤疫苗以及研究免疫细胞间相互作用、肿瘤细胞逃避免疫监视的机制奠定了基础。     

人B7.1(CD80)的真核表达及抗白血病作用

目的:构建人B7.1(CD80)重组真核表达载体,并在HL60细胞上表达,探讨其在急性白血病免疫治疗及免疫保护中的重要作用。方法:①应用分子克隆方法,采用PCR法扩增人B7.1基因片段,ApaⅠ、SalⅠ分别双酶切PCR产物和表达载体pHook,纯化后的酶切产物由T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α,应用ApaⅠ、SalⅠ双酶切和DNA序列分析技术进一步鉴定阳性克隆。②应用脂质体转化技术将B7.1转化HL60细胞,并以FACS检测其表达。③将B7.1~+细胞免疫小鼠,通过成瘤时间及存活时间等指标观察其免疫治疗和免疫保护作用。结果:①PCR法扩增出一大小约620 bp的基因片段;共筛选出6个阳性克隆,均可ApaⅠ、SalⅠ双酶切出大小约620 bp的基因片段,与人B7.1基因片段大小相符,提示重组载体构建成功。进一步DNA序列分析证明人B7.1基因序列和读码框架正确,与文献报道人B7.1cDNA序列一致,无基因突变。②应用FACS在转化HL60上检测到B7.1的高效表达。③B7.1~+ HL60细胞能明显抑制肿瘤生长,延长白血病鼠存活时间,且其免疫预防时成瘤时间较野生型HL60(B7.1-)显著延迟,小鼠存活时间明显延长。结论:应用分子克隆方法可成功构建人B7.1(CD80)重组真核表达载体,并稳定、高效表达于B7.1之急性髓性白血病(AML)细胞系HL60胞膜上,这种共刺激分子瘤苗具有显著     

人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.