非小细胞肺癌通过EPO/EPOR信号促进自身增殖的分子机制研究

目的 研究促红细胞生成素(EPO)及其受体(EPOR)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况及其对NSCLC发生发展的影响.方法 qPCR、western blot检测EPO/EPOR在9种肺癌细胞系中的表达水平;MTT法检测rhEPO促细胞增殖的作用,流式细胞术检测rhEPO对细胞凋亡和周期的影响,Transwell检测细胞迁移;qPCR、western blot检测rhEP0对Cyclin D1和Cyclin A表达水平的影响.结果 EPO/EPOR在部分肺癌细胞中高表达,rhEP0促进高表达EPO/EPOR的肺癌细胞的增殖,而对肺癌细胞凋亡和迁移无影响,rhEP0诱导Cyclin D1表达,使用Jak2/Stat5抑制剂或干涉Jak2/Stat5后rhEP0作用消失.结论 高表达EPO/EPOR非小细胞肺癌通过Jak2/Stat5/Cyclin D1通路促进自身增殖.     

HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid原核表达载体构建及其基因工程菌种稳定性的鉴定

目的 构建HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid的原核表达载体并鉴定其基因工程菌种稳定性.方法 应用PCR技术以pCMV-e23sFv-Fdt-tBid为模板扩增e23sFv-Fdt-tBid片段,并将其克隆人pET-22b原核表达载体;将该表达载体转化BL21大肠杆菌并挑取表达蛋白较高的克隆菌,划线接种传代50次;通过革兰氏染色方法、扫描电镜形态观察、菌种质粒酶切鉴定及蛋白诱导表达的Western blot分析鉴定e23sFv-Fdt-tBid免疫促凋亡蛋白表达工程菌的稳定性.结果 成功构建pET-22b-e23sFv-Fdt-tBid原核表达载体,并在BL21大肠杆菌中诱导表达;革兰氏染色方法、扫描电镜形态观察、菌种质粒酶切鉴定及Western blot法鉴定结果表明基因工程菌种稳定性良好,可以稳定表达免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid.结论 成功构建了HER2靶向免疫促凋亡蛋白原核表达载体,鉴定了表达该免疫促凋亡蛋白的基因工程菌种稳定性,为HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid的应用研究奠定了基础.     

可溶性IL-13受体α2对支气管哮喘小鼠气道炎症的影响

目的通过观察可溶性IL-13受体α2（sIL-13Rα2）对支气管哮喘（简称哮喘）小鼠气道炎症的影响,了解sIL-13Rα2对哮喘潜在的治疗价值。方法 24只BALB/c小鼠随机分成正常对照组、哮喘组及sIL-13Rα2治疗组,哮喘组和sIL-13Rα2治疗组以鸡卵白蛋白（OVA）致敏和激发,建立哮喘模型,对照组用生理盐水代替OVA。sIL-13Rα2治疗组每次激发前30min腹腔注射sIL-13Rα2100μg,正常对照组及哮喘组则用生理盐水替代。比较各组支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数、肺组织学检查。结果与正常对照组相比,哮喘组BALF中细胞总数及嗜酸粒细胞百分比显著增加（P值均〈0.001）,血清及BALF中IL-13明显增多（P值均〈0.001）,病理示肺组织损害明显。与哮喘组相比,sIL-13Rα2治疗组BALF中细胞总数及嗜酸粒细胞百分比显著降低（P值均〈0.001）,血清及BALF中IL-13明显减少（P值均〈0.001）,病理示肺组织损害明显减轻。结论 sIL-13Rα2可明显减轻哮喘小鼠气道炎症。     

重组腺相关病毒Ⅰ型/大鼠肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)的构建和在大鼠体内表达的初步研究

目的构建携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc),并对该病毒在Lewis大鼠体内的表达和生物学活性进行初步研究,探讨以该重组腺相关病毒载体应用于类风湿关节炎基因治疗的可行性.方法首先以RT-PCR分别从大鼠脾细胞和大鼠淋巴细胞总RNA中扩增出大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAVⅠ载体质粒进行重组病毒生产.在获得重组病毒后于Lewis大鼠肌肉注射,于不同时间ELISA测定血清ratTNFR:Fc表达,并以TNF-α细胞毒中和实验测定重组病毒表达产物的生物学活性.结果所构建的重组病毒rAAVⅠ/ratTNFR:Fc基因结构与预期一致;病毒于Lewis大鼠肌肉注射后可表达ratTNFR:Fc蛋白,含有ratTNFR:Fc蛋白的血清可以有效中和大鼠TNF-α对L929细胞的杀伤作用.结论本研究所构建的携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)可以用来作为阻断TNF-α的手段于大鼠类风湿关节炎模型上进行基因治疗研究.     

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽

目的 研究ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＵＳ－ＰＡＧＥ）显示小分子多肽的方法。方法 观察不同方法处理的样品，上样量对电流晰影响及对分子量标准（Ｍ，２５１２＝１６９４９）进行直线回归分析，结果 样品和不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔５～１０μｇ较佳；分子量标准直线回归系数ｒ＝－０．９６２。结论 样品处理方便，上样量少，在１６０ｇ．Ｌ＾－１Ｔ，６０ｇ．ｋｇ＾－１Ｃ较低的丙烯酰胺     

人骨形成蛋白cDNA 1,2A和3在大肠杆菌中的克隆、表达及活性

骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,简称BMP)是一类可以诱导异位宿区间充质细胞分化成软骨和骨细胞的蛋白质,在促进骨修复中具有较高的应用价值,为了在大肠杆菌中有效地表达人BMP,我们将人BMP1,BMP2A和BMP3的cDNA分别插入表达载体中,获得预期结果。1 材料和方法 人骨形成蛋白cDNA 1,2A和3由口腔医学院杨连甲教授赠送,表达载体pBV220由张德震博士赠送,表达载体pSM43由陈苏民教授构建.人BMP1 cDNA先以“缺口双链”定位插入突变技术,将其5’端信号肽序列去掉,并引入起始密码ATG,将经改造的人BMP1 cDNA 5’端1.44     

人FLT3配体的克隆、表达与纯化

目的 克隆人FLT3配体（Flt3Ligand,FL)基因，并在大肠杆菌中对FL进行表达、纯化。方法 分离人外周血单个核细胞，提取总RNA，采用R T－巢式PCR扩增人FLT3配体胞外段基因，以双脱氧终止法进行DNA序列分析；将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-B;处重组质粒pRSET-B-FL转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导后，收集细菌、菌体裂解后，利用常压离子交换色谱的方法对表达蛋白进行纯化，并进行SDS－PAGE及Westernblot检测。结果 从人外周血单个核细胞中克隆得到长462bp的FL基因，测序正确；经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定证实，FL成功地克隆到表达载体pRSET-B;构建的表达载体pRSET-B-FL在大肠杆菌中表达出Mr24000的融合蛋白，经常压离子交换色谱化后的融合蛋白的纯度达到90％，该融合蛋白具有FL抗原特性。结论 成功地克隆并表达了FL基因，并对融合蛋白进行了初步纯化 ，为大规模获得FL创造了条件。     

IFN-α2a - GFE-1融合基因的构建及表达

目的 构建IFN-α 2a-GFE-1融合基因载体，检测其在转染细胞的表达。为肺癌基因导向药物治疗积累实验资料。方法 应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)-α 2a羧基端的酶切位点进行改造，并人工合成肺特异性结合多肽CGFECVRQCPERE(GFE-1)的寡核苷酸片段，二者连接后克隆入pGEM-32zf质粒。连接产物转化感受态DH5 α细胞，挑选阳性克隆经EcoR I Pst I酶切鉴定后测序，将测序正确的目的基因从测序载体相应酶切位点消化回收并纯化后，与上述酶处理过的PBV220质粒连接，连接产物常规转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，经筛选后随机挑选阳性菌落，提取质粒酶切鉴定。结果 序列分析表明合成片段成功的插入IFN-α 2a羧基端，大小、位置、方向均正确无误；融合基因克隆入PBV 220表达载体在大肠杆菌中获得有效表达。结论IFN-α 2a-GFE-1融合基因载体的构建及表达。为检测其在肺内特异性分布及抑瘤活性研究提供了实验基础。     

新型重组人肿瘤坏死因子药代动力学的实验方法

目的 为探讨新型重组人肿瘤坏死因子（nrTNF α）药代动力学而建立生物样品中nrhTNFα的检测方法。方法 （1）方法Ⅰ（RA）：动物肌注^125 Ⅰ标记的nrhTNFα后，测定各生物样品中的总放射活性；（2）方法Ⅱ（HPLC－RA）；上述生物样品无经HPLC分离后，收集并测定其中^125Ⅰ－nrhTNFα部分的放射活性；（3）方法 ⅢELISA法。结果 RA，HPLC－RA法检测的nrhTNFα质量浓度与放射性呈直线相关（RA，r=0.999HPLC－RA,r=0.999)。ELISA法证明nrhTNFα的酶联免疫检测药盒适用于nrhTNFα的检测，nrhTNFα的标准曲线与nrhTNFα的标准曲线显正相关，r=0.994,这一检测系统与其他细胞因子包括IFNα，TNFβ，IL－2和IL－6无交叉反应。结论 RA，HPLC－RA和ELISA法均可作为nrhTNFα的药代动力学实验方法。     

巨噬细胞炎性蛋白4的突变和原核表达

目的 探索如何抑制嗜酸细胞的趋化作用，选择β-趋化因子巨噬细胞炎性蛋白4（MIP4）的突变性（Met-MIP4)作为趋化因子受体3的拮抗剂，将Met-MIP4基因在原核细胞中进行表达。方法 设计MIP4基因的PCR引物并进行氨基酸突变，将MIP4N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸，以正常人肺酸突变，将MIP4N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸。以正常人肺cDNA文库为模板，PCR方法获取Met-MIP4基因，克隆入载体pUC19，测序验证序列已得到突变，将正确的基因插入到GST融合表达载体pGEX-4T中，以IPTG诱导表达。结果 PCR产物为220bp左右的片段，连接入pUC19质粒后测序验证获得正确突变，构建的pGEX-4T融合表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE凝胶电泳显示有大小约34kU的新生融合蛋白表达。结论 成功突变并克隆了β-趋化因子MIP4基因，SDS-PAGE表明，与GST融合的Met-MIP4突变体已得到表达，为进一步研究其生物学活性奠定了基础。