超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞培养上清外泌体的方法学比较

目的对超速离心法与QIAGEN膜亲和柱法提取前列腺癌细胞上清外泌体优缺点进行比较,为外泌体相关基础实验研究及临床检测提供方法学参考。方法收集前列腺癌细胞上清分别用两种方法提取外泌体,进行电镜鉴定、BCA定量测定蛋白浓度、Western blot检测标志蛋白以及Zetaview颗粒粒径、浓度及电势分析,比较两种方法提取外泌体的优缺点。结果电镜下两种方法均可观察到具有膜结构的典型的类似于茶托状结构的外泌体,但膜亲和柱法提取外泌体背景中有类似蛋白聚合物等杂质的存在,超离背景纯净,每个视野下的外泌体数量要明显多于QIAGEN膜亲和柱法;Western blot测定标志蛋白,根据BCA定量同等上样量超速离心法可观察到明显的β-actin,ALIX,CD63以及EGFR条带,而QIAGEN膜亲和柱法仅可观察到β-actin,ALIX以及EGFR条带,但均较超速离心法条带弱;Zetaview粒径分析,超速离心法粒径分布峰值为116 nm,膜亲和柱法提取外泌体分布峰值为122 nm,均符合外泌体的粒径分布范围;电势分析两者均为负值,符合外泌体的电势分布;而颗粒数与蛋白浓度比值超速离心法提取外泌体要高于QIAGEN膜亲和柱法(t=13.47,P0.01)。结论超速离心法与膜亲和柱法均可以从细胞上清中提取外泌体,超速离心法步骤繁琐,时间较长,但外泌体纯度高,杂质少,BCA蛋白定量与实际所含外泌体蛋白量基本一致;QIAGEN膜亲和柱法方法简单,可快速从细胞上清中提取到外泌体,但纯度不及超速离心法,BCA蛋白定量比实际所含外泌体蛋白量要高,超速离心法适用于外泌体的各方面研究,而QIAGEN膜亲和柱法由于有杂蛋白的污染,因此更适用于外泌体核酸分析相关研究。     

2种HBsAg定量检测系统对HBV不同感染阶段及不同基因型样本检测的一致性评价

目的分析罗氏MODULAR E170电化学发光免疫分析系统(简称罗氏E170)和雅培i2000化学发光微粒子免疫分析系统(简称雅培i2000)定量检测慢性乙型肝炎不同感染阶段、不同基因型患者的乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)结果的一致性。方法收集临床未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者血清样本共125例,根据《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中的标准,将样本分为免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和再活动期4组,同时根据基因型(B/C)及HBs Ag水平(HBs Ag≤1 000 IU/m L/HBs Ag1 000 IU/m L)分组。用罗氏E170和雅培i2000 2种系统平行检测HBs Ag,分析各组间2种系统检测结果的一致性。结果 2种系统检测结果总体相关性、一致性好(r=0.989,P均0.001);在4个不同感染阶段,2种系统检测结果的相关性好(r值为0.977~0.993,P均0.001);在一致性分析中,免疫清除期、低复制期和再活动期样本检测结果的一致性较好,但在免疫耐受期罗氏E170检测结果较雅培i2000高,偏差为0.114 log IU/m L;B、C基因型组2种系统检测结果的相关性、一致性均好(r值均0.95,P均0.001);在HBs Ag高水平组中,2种系统检测结果的r值为0.959(P0.001),相关性较HBs Ag低水平组略差,但在专业可接受范围内;且在HBs Ag高水平组中,2种系统的偏差较大,罗氏E170检测结果比雅培i2000平均高0.076 log IU/m L。结论 2种系统检测不同感染阶段及不同基因型样本的相关性和一致性较好,但在检测免疫耐受期及高值样本时罗氏E170结果较雅培i2000偏高。临床上用HBs Ag预测抗病毒治疗的效果时,治疗前后应尽量选择同一系统的结果,以避免由于不同系统间的差异造成对治疗效果的错误评估。     

培养和构建以检验医师为导向的实验室与临床沟通模式

在现代医学发展背景下,检验医学实验室与临床存在沟通不足的现状,制约了检验医学甚至临床医学的发展。这就需要既具有临床医学专业背景,又具备医学检验专业能力的检验医师参与临床诊疗过程中实验室与临床的沟通、协调、衔接和咨询等工作。该文通过分析检验医师在实验室与临床沟通中发挥的作用,探讨培养与构建以检验医师为导向的实验室与临床沟通模式,旨在呼吁业界提高对检验医师培训发展的重视程度,也希望临床能够接纳检验人员参与临床诊疗工作,共同提高医疗水平和促进医学进步发展。     

内毒素单克隆抗体的实验研究

内毒素血症是临床上较难控制的一种疾病，死亡率高达20％～60％。其诊断试验——鲎试验，因其非特异性的缺陷，经常出现假阳性结果，给临床造成误诊。内毒素单克隆抗体自问世以来，迅速发展，为内毒素血症提供了特异、敏感、快速的诊断工具，为其治疗提供了一种特异的免疫制剂。但是，它的应用却受到了内毒素种属差异和体内外各种因素的限制。本文对该方面的研究现状作一综述。     

植绒转运拭子联合显色培养基对鼻腔金黄色葡萄球菌定植的快速筛查

目的采用植绒转运拭子联合显色培养基对鼻腔金黄色葡萄球菌(SA)定植进行快速筛查,了解耳鼻喉头颈外科患者SA定植情况,为预防SA感染和医院感染防控提供依据。方法采用eSwab植绒转运拭子采集某院耳鼻喉头颈外科门诊患者鼻前庭标本,以WASPLab微生物自动化系统接种于羊血琼脂培养基和MRSA/SA显色培养基,孵育培养16、40 h,自动拍摄、观察菌落,通过质谱(MALDI-TOF MS)、药敏试验和mecA基因检测对SA进行验证。结果共采集200份鼻前庭标本,检出SA菌株48株,其中MSSA23株(占47.9%),MRSA25株(占比52.1%),鼻腔SA定植率为24.0%,MRSA定植率为12.5%。SA筛查阳性报告平均时间为(17.6±6.1)h。培养与质谱鉴定、耐药表型检测的符合率为100.0%,与mecA基因检测的符合率为97.9%。结论基于植绒转运拭子联合显色培养基的快速检测方法准确度较高,报告时间较短,可以用于SA定植快速筛查。     

5种结核分枝杆菌Rpf样蛋白的活性鉴定及促生长作用

目的 探讨结核分枝杆菌5种Rpf样蛋白(RpfA、RpfB、RpfC、RpfD、RpfE)的生物学活性及其促生长作用.方法 根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列分别设计5种Rpf样蛋白特异性引物序列,采用PCR技术扩增目的 片段,克隆、表达及纯化结核分枝杆菌的5种Rpf样蛋白,应用获得的Rpf样蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的促生长活性观察.结果 成功获得了纯化的五种Rpf重组蛋白,其浓度分别为374.76μg/mL、300μg/mL、116.27μg/mL、306.9μg/mL、349.8μg/mL;促生长效果观察,其中RpfC无明显的促生长活性,RpfE的促生长活性最明显;A、B和D均有一定程度的促进这三种菌生长增殖的作用.结论 Rpf样蛋白具有促进结核分枝杆菌增殖的作用,有可能成为一种新型的培养基添加剂,为结核菌的快速培养及相关研究奠定基础.     

肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力

目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。     

链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化

目的 构建链霉亲和素（streptavidin,SA）和自噬相关基因（Beclin 1）重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化.方法 利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆人pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定.结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白（含His标签）在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符.结论 本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础.     

婴幼儿急性上呼吸道感染淋巴细胞亚群的改变

目的研究婴幼儿上呼吸道感染时细胞免疫状况的变化情况。方法采用流式细胞仪检测急性上呼吸道感染患儿及正常对照组外周血Th1和Th2的百分率，CD4^＋与CD8^＋细胞百分率，CD4^＋／CD8^＋比值及CD19^＋和CD19^＋CD23^＋的表达水平，以探讨婴幼儿急性上呼吸道感染T淋巴细胞亚群的变化及B淋巴细胞的活化状况。结果上呼吸道感染的患儿的外周血Th1，Th2的细胞百分率（13．15%±6．23%及4．57％±3．10％）均显著高于对照组（7．14％±5．09％及2．03％±0．95％），患儿组CD4^＋细胞百分率亦较对照组为高（P〈0．05）；CD8^＋，CD4^＋／CD8^＋比值均与正常对照组之间无统计学差异（P〉0．05），CD19^＋与CD19^＋CD23^＋的表达阳性率无明显升高。结论婴幼儿上呼吸道感染时可活化T辅助淋巴细胞亚群，表现为Th1扫Th2细胞百分率均增加，Th1和Th2细胞免疫反应增强，而B淋巴细胞状况无明显改变。