SARS-CoV S蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

免疫磁珠法分离人外周血CD4+CD25+调节性T细胞

目的 建立人外周血单个核细胞中CD4 CD25 调节性T细胞(regulatery T cells,Treg)免疫磁性细胞分离力(megnetic activated cell sorting,MACS),并鉴定其分离效率.方法 采用免疫磁珠两步法(即阴性分选和阳性分选2步)分离人周血单个核细胞中的CD4 CD25 调节性T细胞,首先采用生物素标记的鸡尾酒抗体和抗生物素标记的磁珠阴性分选CIM细胞,再用抗CD25 的磁珠阳性分选CD4 CD25 T细胞.分离后的细胞经抗体染色后再通过流式细胞仪检测其分离纯度;内因子染色检测其转录因子FOXV3的表达频率;台盼蓝染色检测细胞的存活率;3H-TdR掺入法检测其对CD4 CD25-T细脆殖抑制效应.结果 阴性分选CD4 T细胞的纯度为(92.2±1.7)%,阳性分选后CD4 CD25 Treg细胞的纯度(95.1±1.2)%.胞内因子染色FOXF3在CD4 CD25 Treg细胞中的表达率为(80.4±1.2)%,台盼蓝染色细胞存活率为(95.6±3.3)%.3H-TdR掺入法检测其对CIM CD25-T细胞具有明显的抑制作用.结论 采用免疫磁性细胞分离技术能够高效、快地得到一群纯度高并且细胞活力好的CD4 CIY25 Treg,为进一步研究其功能提供了方便.     

人PD-1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hPD1Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hPD1Fc融合蛋白。方法PCR方法扩增编码hPD1膜外区的cDNA序列,将其与人IgG1Fc和pcDNA3.1( )片段连接,构建成hPD1Fc重组表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,夹心ELISA法检测上清液中融合蛋白hPD1Fc的表达,经ProteinA亲合层析纯化,SDSPAGE、免疫印迹鉴定表达产物。结果PCR扩增得到编码人PD1全长的288aa编码基因片段,将其膜外区167aa的编码序列与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pcDNA3.1( )表达质粒。重组质粒转染CHO细胞后,夹心ELISA法检测显示培养上清液中有hPD1Fc蛋白表达。纯化后的hPD1Fc蛋白经SDSPAGE和免疫印迹鉴定其相对分子质量约42800,与理论预测值相符。结论成功构建了hPD1Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hPD1Fc融合蛋白,为进一步研究PD1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

磁转联合脂质体实现高效细胞转染

目的优化体外培养细胞的外源基因转染方案。方法采用磁性微粒联合脂质体，将重组人绿色荧光蛋白表达载体（pAAV-IRES-GFP）外源DNA定向转染COS-7细胞，荧光显微镜下观察外源基因的表达，比较不同转染条件及DNA载量的细胞转染效果。结果DNA与Combimag按1：1的比例混合转染可以得到很高的转染效率，过高的DNA载量使转染效率减低。结论利用磁转结合脂质体可使低剂量的DNA达到快速、简便和高水平的转染。     

CT抗原KM-HN-1 HLA-A * 0201限制性表位预测及其与HLA-A * 0201结合强度分析

目的通过对CT抗原（cancer-testis antigen）KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测，并对候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合亲和力及复合物稳定性进行分析，为探索基于KM-HN-1的免疫治疗奠定基础。方法利用基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法PAProc及基于肽MHC-I结合的算法BIMAS和SYFPEITHI对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测．合成KM-HN-1相关候选表位肽KM-HN-I321-329（KLLPFRETV），KM-HN-I303-211，（FLPTAPPNV），KM-HN-I629-637。（TLLQIIETV），KM-HN-I87-95（ILNKSIIEV），KM-HN-I538-596。（QMMEALDQL）及阳性对照肽HBVcAg18-27（FLPSDFFPSV）；对这些合成肽与HIA-A＊0201分子结合亲和力及其复合物稳定性根据文献报道的方法进行分析。结果KM-HN-I321-329（KLLPERETV）结合亲和力最低，KM-HN—I203-211（FLPTAPPNV）结合亲和力最高，其余3条肽结合亲和力介于2者之间；稳定性实验（DC50）结果显示：KM-HN-I538—546（QMMEALDQL）DC50小于2h，KM—HN-I321-329（KLLPERETV）的DC50介于2～4h之间，KM-HN-I87-95。（ILNKSIIEV）的DC50介于6～8h之间，KM-HN-I233-211（HLPTAPPNV）及KM-HN-I629—633（TLLQIIETV）的DC50均大于8h。结论基于蛋白酶体剪切位点特异性的算法及基于肽MHC-I结合的算法对KM-HN-1进行HLA-A＊0201限制性表位预测，结合候选表位肽与HLA-A＊0201分子结合的亲和力与复合物稳定性实验分析，为该抗原HLA-A＊0201限制性表位的鉴定奠定了基础。     

重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达

目的克隆人DcR3基因于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体pAAV-IRES-hrGFP中,以获得高感染滴度及纯度的重组人DcR3腺相关病毒,为将其用于感染移植肝,研究其对大鼠移植肝的保护作用打下基础。方法用基因重组的方法构建含全长人DcR3基因的重组腺相关病毒骨架质粒,利用脂质体法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞AAV-293细胞中,合成重组DcR3腺相关病毒,经PEG/氯仿纯化,用SDS-PAGE鉴定其纯度,扫描电镜观察病毒颗粒形态,倍比稀释法测定重组病毒的感染滴度。并用重组病毒感染COS-7细胞鉴定DcR3的表达。结果正确构建组装重组人DcR3腺相关病毒,纯化后病毒感染滴度为1.1×1010U/mL。在重组DcR3腺相关病毒感染的COS-7细胞上清液中检测到了DcR3的表达。结论成功构建了重组人DcR3腺相关病毒,为下一步研究DcR3对大鼠移植肝的保护作用打下基础。     

肿瘤细胞诱导T细胞下调表达腺苷脱氨酶

目的 蛋白质组学分析鉴定与肿瘤细胞共培养T细胞的表达差异蛋白.方法 双向电泳分离有/无肿瘤细胞共培养的T细胞蛋白,PDQuest软件分析筛选肿瘤细胞诱导表达异常的蛋白点,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MAL-DI-TOF MS)对酶解消化样品进行肽质量指纹图谱(PMF)分析,结合数据库搜索鉴定蛋白质.结果 PDQuest分析有/无肿瘤细胞共培养的T细胞蛋白双向电泳图谱,70余个蛋白点表达水平差异显著,其中与肿瘤细胞共培养的T细胞有一明显表达下调的蛋白点,质谱分析结合数据库检索表明该蛋白点为腺苷脱氨酶.结论 肿瘤细胞诱导T细胞下调表达腺苷脱氨酶.     

人脐静脉内皮细胞清除补体攻膜复合物的机制

目的：探讨内皮细胞清除补体攻膜复合物（MAC）的途径及其清除动力学，方法：原代培养的人脐静脉内皮细胞以RH414荧光标记质膜双层，0℃组装亚溶剂量的MAC，37℃复苏后，LSCM实时监MAC沉积诱导的质膜囊泡化形成和胞吞，胞吐情况,流式细胞仪定量检测内皮细胞表面MAC抗原的清除情况，结果：MAC沉积后，内皮细胞有的质膜囊泡化形成，囊泡以胞吞和胞吐2种方式离开细胞，并以前者占优，37度条件下，内皮细胞清除表面MAC的半衰期约为5min。结论：内皮细胞可通过胞吞和胞吐2种机制清除细胞表面沉积的MAC，并以胞吞方式为主。     

重组跨膜型人CD55分子在小鼠NIH3T3细胞上的表达及其补体溶破保护功能的研究

目的 :在小鼠NIH3T3细胞转染表达人天然GPI锚固型CD5 5和重组跨膜型CD5 5 TM分子 ,观察比较它们对人补体溶破异源细胞的抑制功能。方法 :将带有CD5 5cDNA、CD5 5 TMcDNA的重组逆病毒表达质粒CD5 5 pLXSN、CD5 5TM pLXSN经脂质体法转染PA317细胞 ,用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3。经G418加压筛选 ,利用FACS检测获得表达CD5 5和CD5 5 TM分子的阳性细胞克隆 ,通过MTT比色法比较两种分子对人血清补体溶破细胞的抑制功能有无差别。结果 :细胞转染筛选获得多个表达跨膜型人CD5 5分子的NIH3T3细胞克隆 ,补体杀伤试验证实其具有抑制人补体溶破的功能 ,且两种分子的补体抑制功能无明显差异。结论 :成功地建立了稳定表达天然CD5 5、跨膜型CD5 5分子的小鼠NIH3T3细胞 ,证实其表达的GPI型CD5 5分子和CD5 5TM分子均具有抑制人补体溶破细胞的功能 ,为进一步探讨应用跨膜型的CD5 5分子对PNH进行基因治疗奠定了基础。     

衰变加速因子在Jurkat细胞增殖及分泌IL—2中的作用

目的 研究衰变加速因子对CD3阳性与阴性Jurkat细胞的增殖效应及对IL－2分泌的影响。方法 应用MTT比色实验观察交联DAF单抗DG3与固相化抗CD3联合作用对CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞增殖效应;IL－2依赖CTLL^3H-TdR掺入实验检测CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞IL－2的分泌;细胞ELISA检测CD3阳性与CD3阴性Jurkar细胞IL－2R的表达。结果 交联DG3可协助促进固相化抗CD3对CD3阳性Jurkat细胞的增殖效应和IL－2分泌,并可引起IL－2Rα链表达增加,此作用可被Src家族酪酸激酶抑制剂PP2所抑制,而对CD3阴性Jurkat细胞无此作用。结论 衰变加速因子可协同促进固相化抗CD3对CD3阳性Jurkat细胞的刺激增殖效应、IL－2分泌及IL－2R表达增加。