pEGX—e23（scFv）PE40融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达抗原癌基因c-erbB-2表达产物p185的单链抗体e23(scFv)／假单孢菌属外毒素活性片段PE40免疫毒素的融合,9搂乳腺癌、胃癌等多种c-erbB-2呈过量表达的恶性肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法 去除克隆在真核表达载体pLNCX中的e23(scFv)PE40基因5′端编码信号肽的核苷酸序列，并将改建后的融合基因克隆到原核融蛤 表达载体pGEX-4T中表达。结果 序列测定表明，改建后抗p185 e23(scFv)／PE40序列正确。融合基因经IPTG诱导表达4h后，经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，在Mr90000处出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的15％。结论 成功改建并在原核中表达了抗p185 e23(scFv)PE40融合蛋白。     

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析小分子多肽

目的 研究ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＵＳ－ＰＡＧＥ）显示小分子多肽的方法。方法 观察不同方法处理的样品，上样量对电流晰影响及对分子量标准（Ｍ，２５１２＝１６９４９）进行直线回归分析，结果 样品和不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔５～１０μｇ较佳；分子量标准直线回归系数ｒ＝－０．９６２。结论 样品处理方便，上样量少，在１６０ｇ．Ｌ＾－１Ｔ，６０ｇ．ｋｇ＾－１Ｃ较低的丙烯酰胺     

MUC1基因疫苗抑制EMT6乳癌生长的实验

目的 :观察MUC1基因疫苗对EMT6乳癌生长的特异性抑制作用 .方法 :采用股四头肌肌肉注射法将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3 1 MUC1免疫雌性BALB/c小鼠 ,3wk 1次 ,共 3次 .最后一次基因免疫后第 3周 ,接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞 .2wk后观察、记录肿瘤的生长情况 .于肿瘤细胞接种后第 4 5日 ,处死全部动物 ,称量肿瘤的质量 .荷瘤小鼠的瘤组织常规HE染色 .结果 :肿瘤细胞接种后 4 5d ,MUC1预防组、质粒pcDNA3 1对照组及生理盐水阴性对照组EMT6肿瘤大小分别为 (2 5 0± 2 4 3) ,(5 96±2 8 2 )及 (6 18± 35 6 )mm3 (P <0 0 1) ;平均瘤质量为 (1 2 3±0 4 1) ,(2 2 8± 0 6 6 )及 2 36± 0 72 )g(P <0 0 1) ;MUC1基因疫苗预防组仅见 4 0 % (4 / 10 )的小鼠有瘤体形成 ,而pcD NA3 1对照组及生理盐水阴性对照组 10 0 % (10 / 10 )可见瘤体形成、肿瘤生长 .结果表明 ,与pcDNA3 1对照组相比 ,MUC1预防组EMT6肿瘤生长受到明显抑制 (P <0 0 1) ;MUC1预防组小鼠免疫保护有显著差异 (P <0 0 5 ) .病理学检查结果显示 ,与 pcDNA3 1对照组相比 ,MUC1DNA疫苗预防组鼠EMT6肿瘤组织大量坏死 .结论 :MUC1基因疫苗显著抑制EMT6乳癌生长 ,为临床应用研究奠定了基础     

血管生长抑制因子基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

目的;获得具有高活性的Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ表达,为进一步研究及应用奠定物质基础。方法：用ＰＣＲ法人纤维蛋白酶原ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ基因中,获得Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（ｋｒｉｎｇｌｅｌ－４）基因,测序验证后,将正确的Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ（Ｋ１－４）序列,插入Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ杆状病毒表达系统,转染昆虫细胞ｓｆ９,表达Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ。结果：获得了正确序列Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

人血管形成素cDNA克隆和序列分析

０　引言　人肿瘤的发生、转移和血管形成密不可分．近年来,已发现多种具有血管形成活性的因子,如纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）,转化生长因子（ＴＧＦ）,血管形成素（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）等．其中血管形成素是第一个肿瘤来源的具有血管形成活性蛋白,在体外可以诱导鸡胚绒毛尿囊膜及兔角膜血管形成［１］,因此可能在肿瘤发生中有重要作用．文献［２,３］报道,从人肝ｃＤＮＡ文库中获得人血管形成素的基因全长,并推导出氨基酸．我们利用ＲＴＰＣＲ从人肺癌细胞株Ａ５４９中提取总ＲＮＡ,成功克隆了人血管形成素ｃＤＮＡ,其序列…     

GM-CSF对MUC1基因疫苗抑制乳腺癌生长的增强作用

目的 :观察GM CSF有无增强MUC1基因疫苗对EMT6乳腺癌生长的特异性抑制作用。方法 :采用股四头肌肌肉注射法 ,将构建的MUC1基因疫苗pcDNA3.1 MUC1免疫雌性BALB/c小鼠 ,每 3wk 1次 ,共 3次。每次基因免疫后 1、3、5d ,皮下注射GM CSF 10 0 μL(1μg/ 10 0 μL)。最后 1次基因免疫后第 3周 ,接种表达MUC1的EMT6小鼠乳腺癌细胞。两周后观察、记录肿瘤的生长情况。于肿瘤细胞接种后第 4 3天 ,处死全部动物 ,称量肿瘤的质量。用 4h51Cr释放法检测小鼠脾特异性CTL的杀伤活性。结果 :接种肿瘤细胞后 4 3d ,MUC1基因疫苗加GM CSF组、MUC1基因疫苗组、pcDNA3.1加GM CSF组及pcDNA3.1组 ,EMT6肿瘤的大小依次为 (135± 33.8)mm3 、(2 5 0± 34.3)mm3 、(5 6 8± 4 3.6 )mm3 和 (5 96± 4 8.2 )mm3 ;平均瘤质量 (g)依次为 (0 .81± 0 .4 2 )g、(1.2 3± 0 .4 1)g、(2 .30± 0 .4 8)g及 (2 .2 8± 0 .5 8)g。与对照组相比较 ,MUC1基因疫苗组EMT6肿瘤的生长受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ;与单独MUC1基因疫苗组相比较 ,MUC1基因疫苗加GM CSF组抗肿瘤生长的作用有显著差异 (P <0 .0 5 )。在效靶比为 10 0∶1、5 0∶1、2 5∶1和 12 .5∶1时 ,MUC1基因疫苗加GM CSF组特异性CTL对EMT6靶细胞的杀伤率 ,依次为 6 8.5 %、 5 3.4 %     

肿瘤坏死因子新型免疫抑制剂的构建、表达和鉴定

目的 用鸡卵清溶菌酶(Hen egg-white lysozyme，HEL)T辅助细胞表位序列替换hTNF-α3^ 末端序列，构建和表达hTNF-α新型免疫抑制剂。方法 将重组的hTNF-α HEL克隆、表达、纯化后进行初步的生物学活性鉴定。结果 DNA测序分析表明，重组的hTNF-α HEL3^ 末端序列与设计序列完全相同。将其插入pBV220表达载体中，重组菌经42℃诱导4h做SDS-PAGE分析，结果 显示该免疫抑制剂获得了表达，Mt为17000，其表达量为菌体总蛋白量的30％。Western blot结果证实，该表达蛋白可与抗TNF-α抗体产生免疫反应。对该表达蛋白进行了阴离子交换柱纯化，获得的重组蛋白的纯度可达95％以上。对该蛋白的体外杀伤活性检测表明，该蛋白已完全丧失了TNF-α的体外杀伤活性。结论 上述实验结果证明，TNF-α免疫抑制剂的构建获得了成功，该免疫抑制剂既保持了与TNF-α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性，为其下一步治疗作用的研究奠定了基础。     

MUC1在原发性肝癌和肝硬化组织中的表达及其意义

目的　探讨MUC 1在原发性肝癌及肝硬化病变组织中的表达及其在肝癌诊断和免疫治疗中的意义。方法　采用免疫组化方法检测 43例原发性肝癌组织 (肝细胞癌 3 4例 ,胆管细胞癌 9例 )和 12例肝硬化及 6例正常肝组织中MUC1的表达。结果　肝癌组织中可见MUC 1强阳性表达 ,阳性反应信号为棕黄色颗粒 ,主要位于细胞膜上 ;肝硬化病变组织中仅 2例可见MUC 1弱阳性反应信号 ;正常肝组织中未见MUC1表达。MUC1在肝癌组织中的阳性表达率与其它两组肝组织之间存在统计学差异 (P <0 .0 1)。MUC 1在肝癌组织中阳性表达与肝癌组织的病理类型和组织学分化无明显关系 (P >0 .0 5 ) ;门静脉有无癌栓两组之间有差异显著性 (P <0 .0 5 )。结论　MUC1在肝癌组织中的表达及分布特点可作为肝癌的辅助鉴别诊断指标 ,有可能作为肝癌免疫治疗的靶抗原。     

RB的研究进展

视网膜胚细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,RB)是一个110 kD的核磷酸蛋白。在许多人恶性肿瘤中发现,该蛋白由于基因发生缺失和突变而失活,表明它与细胞恶性变过程有密切的联系。近年来发现RB还可与许多细胞蛋白结合并抑制细胞的生长,其抑制作用在细胞周期中受磷酸化的调节,该调节又与几个RB激酶有关。     

人FLT3配体的克隆、表达与纯化

目的 克隆人FLT3配体（Flt3Ligand,FL)基因，并在大肠杆菌中对FL进行表达、纯化。方法 分离人外周血单个核细胞，提取总RNA，采用R T－巢式PCR扩增人FLT3配体胞外段基因，以双脱氧终止法进行DNA序列分析；将测序正确的目的基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-B;处重组质粒pRSET-B-FL转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导后，收集细菌、菌体裂解后，利用常压离子交换色谱的方法对表达蛋白进行纯化，并进行SDS－PAGE及Westernblot检测。结果 从人外周血单个核细胞中克隆得到长462bp的FL基因，测序正确；经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切鉴定证实，FL成功地克隆到表达载体pRSET-B;构建的表达载体pRSET-B-FL在大肠杆菌中表达出Mr24000的融合蛋白，经常压离子交换色谱化后的融合蛋白的纯度达到90％，该融合蛋白具有FL抗原特性。结论 成功地克隆并表达了FL基因，并对融合蛋白进行了初步纯化 ，为大规模获得FL创造了条件。