神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

人类肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体真核表达质粒的构建与临床意义

目的：为实现高表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)治疗前列腺癌,通过分子生物学技术构建TRAIL基因的真核表达质粒。方法：采用RT-PCR技术,从HL-60、Jurkat细胞mRNA中扩增出人类TRAIL基因序列,利用基因工程技术将其插入到真核表达载体pLXIN中获得重组质粒pLXIN-TRAIL,并进行酶切鉴定和DNA序列分析。结果：RT-PCR获得预期的扩增产物TRAIL884bp基因片段,成功构建pLXIN-TRAIL重组质粒,酶切鉴定及测序结果与预期相符。结论：重组克隆载体pLXIN-TRAIL构建成功。     

人钙调磷酸酶-B真核表达质粒的构建

目的 为研究钙振荡现象,构建人钙调磷酸酶-B(CNB)基因的真核表达质粒.方法 采用RT-PCR技术,从MCF-7细胞中扩增出人CNB基因序列;利用分子克隆技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.0中,并进行酶切鉴定和DNA测序.结果 琼脂糖凝胶电泳分析显示RT-PCR产物为预期分子量大小,酶切鉴定图谱正确,DNA测序结果经核实完全符合.结论 成功构建人CNB基因的真核表达质粒,为进一步研究钙振荡现象打下了基础.     

大鼠心肌细胞钙调磷酸酶Aβ基因的克隆与真核表达

目的 从原代培养的大鼠心肌细胞中扩增钙调磷酸酶( Calcineurin,CaN)Aβ cDNA序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-CaN,并检测其表达情况,为进一步研究CaN及其在心肌损伤的信号转导途径中的作用奠定基础.方法 用RT-PCR方法从原代培养的大鼠心肌细胞RNA中扩增出CaN A β cDNA序列,测序后将其用限制性内切酶双酶切,然后与真核表达质粒pcDNA3.1(+)进行连接,再转化DH5α,将鉴定为阳性的真核表达质粒转染人胚肾293T细胞,用免疫荧光细胞化学技术检测其表达情况.结果 ①将鉴定为阳性的质粒进行测序后,所测序列结果与GeneBank的CaNAβ基因序列同源性达到91.7%;②真核表达载体pcDNA3.1-CaN转染293T细胞后经免疫荧光细胞化学染色检测到钙调磷酸酶基因在人胚肾293T细胞中表达.结论 正确克隆出了大鼠心肌细胞CaNAβ基因并建立了CaNAβ基因的真核表达栽体pcDNA3.1-CaN.     

基于戊型肝炎病毒中和表位的基因免疫表达载体的构建与鉴定

目的：获得戊型肝炎病毒(HEV)中和表位p166的编码基因，构建基于该中和表位的HEV基因免疫的真核表达载体。方法：应用RT-PCR方法从粪便标本中扩增获得HEV VOF2中G6461～G7035片段，通过比较核酸序列同源性鉴定其基因型，PCR方法扩增该片段中HEV中和表位p166的编码基因，经酶切后克隆于真核表达载体pTR421质粒，并以PCR、酶切和DNA测序加以鉴定。结果：成功克隆了p166的编码基因，其基因型别为Ⅳ型；经酶切鉴定和DNA测序证实p166的编码基因已成功插入pTR421质粒，且核酸序列、读码框架正确结论：成功构建含Ⅳ型HEV中和表位编码基因的重组质粒，为后续基于HEV中和表位基因免疫的研究奠定基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

hTERT片段真核表达质粒的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法：从肿瘤组织中提取总RNA．采用RT—PCR法扩增hTERT基因并克隆人PGEM—T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3．1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定。结果：PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98．73％,氨基酸序列的同源性为99．68％。结论：成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。     

脂氧素A4受体样蛋白基因的克隆与转染及其在Hela细胞的表达

目的：构建脂氧素A4受体样蛋白(LRLP)基因的真核表达载体，克隆后转染Hela细胞，观察LRLP基因在Hela细胞中的表达。方法：应用PCR方法．以小鼠睾丸cDNA为模板，扩增出LRLP基因片段，插入质粒pGEM—T中，转化人大肠杆菌JM109。扩增阳性重组质粒，经酶切后纯化并测序鉴定目的片段。构建含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP／LRLP，转化人大肠杆菌JM109扩增．酶切后再测序鉴定目的片段，抽提质粒后瞬时转染Hela细胞，置激光共聚焦显微镜下照像。结果：测序鉴定表明．克隆的LRLP序列与GenBank中LRLP原序列100％．符合，激光共聚焦显微镜下见Hela细胞中LRLP基因表达。结论：成功地构建了真核表达载体pEGFP／LRLP，并转染了Hela细胞。     

人纤溶酶真核表达重组质粒的构建

目的：构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究。方法：人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序。经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性。结果：目的基因 PCR扩增产物为1 740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶
酶基因全长序列。结论：成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定。     

pLIVE—IL-1β表达载体的构建及在Hepal- 6细胞的表达

目的构建应用于体内表达和研究的小鼠IL-1β肝癌细胞特异性表达载体，观察其在小鼠HE—PA1-6细胞中的表达水平。方法分离BALB／c小鼠外周血淋巴细胞，LPS刺激后提到总RNA，RT—PCR扩增IL-1β基因，与pLIVETM连接构建pLIVE-IL-1β重组表达载体，并通过菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列分析进行鉴定。利用TransITTM将pLIVE-IL-1B转染至Hepa1-6肝癌细胞，RT—PCR分析IL-1β的表达水平。结果从小鼠腹腔巨噬细胞中RT-PCR扩增得到一822bp的片段，纯化的PCR产物与pLIVETM同时经XhoⅠ和NheⅠ双酶切后连接，菌落PCR鉴定获得多个阳性克隆，经质粒XhoⅠ4-NheⅠ限制性酶谱分析，酶解出822bp的条带，DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GeneBank登录的小鼠IL-1β基因一致。将该载体转染Hepal-6细胞，RT．-PCR证实，与转染pLIVETM的对照细胞相比，IL-1β的表达水平明显升高。结论成功构建了小鼠IL—1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL—1β，该载体能够在小鼠肝癌细胞中稳定高效表达IL-1β。     

细菌内同源重组构建pAdeasy-1/hp27mt腺病毒质粒

目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含hp2 7mt基因的重组腺病毒质粒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,构成穿梭质粒 pShuttle -CMV/hp2 7mt;然后再用经PmeI酶切的 pshuttle-CMV/hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAdeasy - 1 /hp2 7mt;筛选同源重组质粒阳性克隆 ,提取pAdeasy - 1 /hp2 7mt质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果 :线性化的pShuttle-CMV/hp2 7mt转化含pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,1 2 - 2 0h后获得了30 %阳性重组质粒克隆 ,经酶切获得一大于 2 0kb的大片段和 3 .0kb的特征性片段 ,PCR反应扩增出了 2 75bp的片段 ,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp2 7mt。 结论 :用细菌内同源重组法可制备含hp2 7mt的重组腺病毒质粒且经济高效、简便、快捷。为转染 2 93细胞制备高滴度重组腺病毒提供高纯度的重组腺病毒质粒     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

PML-RARα245-hIL-2双基因表达载体的构建和表达研究

目的：采用长度为245 bp的PML-RARα融合基因片段构建一种新的PML-RARα融合基因与人白介素-2（hIL-2）基因真核双表达质粒。方法：利用RT-PCR从NB4细胞的RNA中扩增出包含PML-RARα基因融合点的长度为245 bp的基因片段,通过RT-PCR从Jurkat细胞中扩增hIL-2基因,并将两基因片段分别克隆到pIRES质粒中,通过酶切和测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒转染A549细胞,通过RT-PCR检测该质粒在真核细胞中的转录情况,利用点杂交和ELISA技术检测目的蛋白的表达。结果：Nhe I/Mlu I和Sal I/Not I双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα融合基因片段和hIL-2基因,测序结果证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将构建的pIRES-PML-RARα245-hIL-2质粒转染A549细胞后经RT-PCR鉴定表明,插入到重组质粒中的PML-RARα和hIL-2基因能够在真核细胞中进行正常转录并翻译出相应蛋白。结论：成功构建了含有245 bp的PML-RARα基因与hIL-2基因的真核双表达载体,该载体能够在真核细胞中正常转录并翻译出PML-RARα和hIL-2蛋白,为利用DNA疫苗治疗急性早幼粒细胞白血病提供了更丰富的资料。     

PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的：构建PIAS3 （活化型STAT3抑制蛋白）的Myc融合蛋白真核表达重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法： 采用PCR方法，扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上，将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果：重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4 357和1 318 bp 2条带，XbaⅠ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带，与预期结果一致。测序结果显示，13个氨基酸Myc在N端，然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达，在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带。结论：成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。     

重组腺病毒载体pAd-NY-ESO-1-EGFP的构建及鉴定

目的:利用细菌内同源重组法构建含人肿瘤特异性抗原的腺病毒质粒。方法:设计NY-ESO-1 cDNA扩增引物,从pET15b-NY-ESO-1质粒中扩增NY-ESO-1的DNA序列,与pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,PCR和EcoRⅤ酶切鉴定重组质粒pShuttle-NY-ESO-1-EGFP,经Pm eⅠ酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-NY-ESO-1-EGFP;质粒经PacⅠ酶切鉴定,DNA测序。结果:线性化的pShuttle-NY-ESO-1-EGFP转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了340 bp的片段。结论:用细菌内同源重组法成功地构建了含NY-ESO-1的重组腺病毒质粒,为进行表达NY-ESO-1的重组腺病毒的制备及肿瘤特异性抗原NY-ESO-1的核酸疫苗在肿瘤方面的研究奠定了基础。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。     

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。