LMP1羧基末端第三活性区对鼻咽上皮细胞生物学特性的影响

目的探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1（LMP1）羧基末端第三活性区在鼻咽上皮细胞生长中的作用。方法采用逆病毒感染的方法,建立稳定表达野生型LMP1（LMP1^WT）和突变型LMP1（LMP1^△232-351）的鼻咽上皮细胞（NP69）系,然后通过细胞生长曲线、平皿克隆形成与软琼脂集落实验、细胞周期与抗凋亡检测等方法,观察LMP1羧基末端第三活性区对鼻咽上皮细胞生物学特性的影响。结果LMP1^△232-351体外促转化细胞生长能力较LMP1^WT明显降低（P〈0.01）;NP69-LMP1^△232-351细胞的凋亡与细胞G1期分布均较NP69-LMP1^WT细胞增加（P〈0.01）。结论LMP1羧基末端第三活性区可能通过调节细胞周期与凋亡而影响鼻咽上皮生物学特性。     

EB病毒潜伏膜蛋白2A1-119重组质粒的表达及鉴定

目的：构建含EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）潜伏膜蛋白（LMP）2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法：采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果：pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论：EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。     

下调STGC3基因表达对NP69细胞增殖的影响

目的探讨STGC3基因在鼻咽癌发生发展中的作用机制。方法设计基于miRNA30框架的STGC3特异性shRNA,构建STGC3特异性miR30-shRNA真核表达载体pRNAT-U6/shRNA-STGC3,转染永生化人鼻咽上皮细胞系NP69;采用RT-PCR检测未转染、转pRNAT-U6空质粒和转pRNAT-U6/shRNA-STGC3组NP69细胞中STGC3基因mRNA的表达;使用流式细胞仪检测3组细胞周期分布与细胞凋亡情况。结果与未转染组和转pRNAT-U6空质粒组相比,转染pRNAT-U6/shRNA-STGC3的NP69细胞中STGC3基因mRNA表达下降（P（0.05）,G0/G1期细胞比例下降,G2期和S期的细胞比例之和增加（P（0.05）。结论 miR30-based shRNA成功地下调了STGC3在NP69细胞系中的表达;STGC3基因在NP69细胞系的表达下调,使NP69细胞生长增殖速度加快,凋亡减少,提示STGC3对NP69细胞增殖具有抑制作用。     

EB病毒LMP1蛋白CTAR23结构域的原核表达及纯化

目的 获得纯化的LMP1 CTAR23结构域蛋白。方法 用RT—PCR方法从B95—8细胞中扩增EBV LMP1 CTAR23结构域的cDNA，将其克隆至PGEM-T easy载体后进行测序鉴定。亚克隆至原核表达载体PGEX-6P-3，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导重组菌株表达。用SDS—PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定，用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化，PreScission Proteas酶对融合蛋白进行解离。结果 扩增的LMP1 CTAR23长度为357bp，测序结果与已知序列吻合。获得PGEX-6P-3-CTAR23原核表达菌株，Western blot表明重组蛋白能被LMPI单克隆抗体特异结合。获得约42000u的PGEX-6P-3-CTAR23融合蛋白，分离纯化出约13000u的LMP1 CTAR23蛋白。结论 成功获得EBV LMP1 CTAR23蛋白，为研究LMP1致瘤机制，研制生物抗癌药物奠定基础。     

足月新生儿缺氧缺血性脑损伤大鼠模型的制作与鉴定

目的检测狂犬病毒NP蛋白的免疫原性。方法利用RT-PCR扩增狂犬病毒核蛋白（NP）基因,测序后将其克隆到PVAXl真核表达载体上：将PVAX1-NP转染Vero细胞,进行SDS．PAGE,TLWestern—blot分析;以重组质粒PVAX1-NP对小鼠进行免疫试验。结果经酶切分析、鉴定和测序验证,得到重组表达质粒PVAX1-NP,NP蛋白在Vero细胞中获得了表达,且表达产物具有免疫学活性：免疫小鼠抗体水平显著升高。结论狂犬病毒NP蛋白具有免疫原性。     

Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端的克隆与原核表达

目的　构建PGEX 6P 3 CCT原核表达载体 ,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白。方法　通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBVLMP1CCTcDNA ,克隆至PGEM Teasy载体上并测序。利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX 6P 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达 ,用SDS PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定 ,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化 ,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果　扩增的LMP1CCT长度为 5 97bp ,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定 ,获得PGEX 6P 3 CCT原核表达菌株 ,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约5 1kDa的PGEX 6P 3 CCT融合蛋白 ,分离纯化出约 2 1kDa的LMP1CCT蛋白。结论　成功获得EBVLM1CCT蛋白 ,为研究LMP1致瘤机制 ,研制生物抗癌药物奠定基础     

EB病毒LMP1 C端原核表达质粒的构建

目的 通过巢式PCR技术扩增EB病毒LMP1 C端,并构建其原核表达重组质粒,经诱导获得EB病毒LMP1C端蛋白.方法 用巢式PCR技术,从B95-8细胞中扩增EBV-LMP1 exon c DNA,克隆至pET-32a载体,转化入原核表达菌BL21,IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定.结果 巢式PCR扩增的LMP1exon c DNA长度为801 bp,测序结果与LMP1 C端cDNA序列吻合,诱导pET-32a-LMP1c重组原核表达菌株获得大小约48×103的LMP1 C端融合蛋白,Western blot表明重组蛋白能与LMP1单克隆抗体特异结合.结论 通过巢式PCR成功构建了原核表达载体,获得的EB病毒LMP1 C端融合蛋白为制备国产LMP1单克隆抗体,研究LMP1致瘤机制奠定了基础.     

鼻咽上皮细胞中过表达PIN1 激活JNK信号通路上调CyclinD1的研究

目的：研究肽脯氨酰异构酶PIN1（prolylisomerase,PIN1）可能影响的肿瘤信号通路和相关基因,探讨鼻咽癌早期发生发展的机制。方法：运用慢病毒表达系统在鼻咽上皮细胞系 NP69 中建立PIN1 过表达细胞克隆株,real-time PCR、Western blot检测PIN1表达情况;肿瘤信号通路阵列荧光素酶实验筛选PIN1可能影响的细胞信号通路,Western blot加以验证。结果：稳定表达 PIN1 的NP69 细胞可激活一系列肿瘤信号通路其中激活丝裂原活化蛋白激酶MAPK/c-Jun氨基末端激酶JNK（MAPK/JNK） 信号通路,差异具有统计学意义（P<0.01）,核转录因子－κB（P=0.036）、癌基因Myc（P=0.048）信号通路变化具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示与对照组相比,稳定表达 PIN1 的NP69实验组可明显上调JNK 信号通路重要的下游转录因子c-Jun、c-Jun Ser63、c-JunSer73的表达量,最终上调下游基因细胞周期蛋白CyclinD1（t=-7.295,P=0.002）的表达。结论：稳定表达 PIN1 的NP69 细胞可激活MAPK/JNK信号通路,明显上调JNK 信号通路重要的下游转录因子c-Jun、c-Jun Ser63、c-JunSer73的表达量,最终上调下游基因细胞周期蛋白CyclinD1的表达,PIN1与鼻咽癌早期的发生发展密切相关。     

经典性霍奇金淋巴瘤中EB病毒潜伏膜蛋白1的表达

目的 探讨经典性霍奇金淋巴瘤（cHL)肿瘤性H／R－S细胞埃泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏膜蛋白1（LMP1）的表达情况及其意义。方法 采用免疫组化SABC法对32例cHL进行LMP1蛋白表达的检测。结果 20／32（62．5％）例LMP1蛋白表达阳性、在各亚型之间没有显著性差异（X^2=0.0809,P=0.847)。结论 LP1蛋白表达有地区差异,在cHL亚型间可能没有分型差异性。     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

两种不同来源的EBV LMP1基因在Balb/c 3T3细胞中的表达

【目的】研究来源于鼻咽癌细胞株SUNE1及EBV标准株B95 - 8细胞中两种EBVLMP1基因在真核细胞Balb/c3T3中的表达 ,为进一步研究EBVLMP1基因的核酸疫苗打基础。【方法】将两种不同来源EBVLMP1基因的真核表达质粒 ,经脂质体法转染Balb/c 3T3细胞后 ,用Westernblot、免疫组化及PCR的方法检测不同转染细胞中EBVLMP1蛋白的表达及核酸片段。【结果】PCR结果表明在两种不同来源LMP1转染细胞中均有EBVLMP1基因序列 ,并均能表达 6 3ku的蛋白质 ,经Westernblot和免疫组化结果证实均为EBVLMP1蛋白。【结论】来源于B95 8细胞及鼻咽癌细胞SUNE1的两种EBVLMP1基因均能在真核细胞Balb/c 3T3中表达。     

利用慢病毒载体系统构建稳定表达癌基因PIN1的鼻咽上皮细胞株

目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达癌基因肽脯氨酰异构酶PIN1的鼻咽上皮细胞株,用于后续生物学功能方面研究。方法将病毒载体p CDH-PIN1用Lipofectamine转染到293TN细胞,收集含有PIN1病毒颗粒的培养液加入NP69细胞进行培养。荧光显微镜观察慢病毒载体GFP发光率、RT-q PCR、Westernblot验证PIN1的表达情况。结果荧光显微镜观察发现PIN1基因已整合到94%±2.09%的NP69细胞中,转染效果稳定。RT-q PCR、Westernblot检测发现NP69-PIN1组中PIN1的mRNA和蛋白水平明显高于对照组和空白组。结论课题组利用慢病毒载体系统成功在鼻咽上皮细胞构建PIN1过表达株。     

不同转移习性人鼻咽癌细胞株中外泌体的提取及鉴定

目的 探索不同转移习性人鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞外泌体的表达情况,为进一步研究鼻咽癌的诊断和治疗新方法提供一定的理论基础。 方法 在2018年5月—2019年6月期间,用Exosome提取试剂盒从SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69培养上清液分离出外泌体,使用透射电镜进行观察验证外泌体形态,BCA试剂盒测定外泌体蛋白的浓度,蛋白质印迹法(Western blotting)法进行外泌体特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1的检测。 结果 3种鼻咽癌细胞系和正常鼻咽上皮细胞上清液中均分离出泡状物,在透射电镜下呈椭圆形或者圆形的泡状物。SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69细胞系外泌体蛋白浓度分别为0.778、0.635、0.788、0.576μg/μL;且所有细胞系来源的外泌体经检测均表达特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1。 结论 3种鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞均产生外泌体。      

鼻咽癌淋巴结转移动物模型的建立及其转移相关标签基因的筛选

目的 建立稳定的鼻咽癌(NPC)淋巴结转移模型,筛选鼻咽癌淋巴结转移的候选标志基因.方法 我们用鼻咽癌5-8F-EGFP细胞株建立了稳定淋巴结转移可视化裸鼠模型,筛选获得具有淋巴结转移潜能的5-8F-LN鼻咽癌细胞.通过文献数据挖掘获得乳腺癌,头颈部鳞癌等肿瘤的转移标签基因和淋巴结转移标签基因.结合鼻咽癌5-8F和6-10B细胞株约307个差异性表达基因得到21个重叠的基因,最终分析得到3个可能促进恶性肿瘤转移的高表达基因:ADM,IRF1和CAV1.通过荧光定量PCR验证在5-8F.EGFP,6-10B-EGFP,5-8F-LN和NP69细胞中的表达情况.结果 IRF1在5-8F-EGFP、6-10B-EGFP和5-8F-LN中的表达远高于在NP69中的表达,且差别有统计学意义(p=0.008、0.022、0.006);CAV1在5-8F-EGFP中的表达高于其在6-10B-EGFP中的表达(p=0.014);ADM在4种细胞中的表达无明显差别.结论 IRF1可能在鼻咽癌演进过程中起着重要作用,而CAV1在5-8F-EGFP中的相对高表达可能和其高转移特性有关.     

鼻咽癌细胞系抗失巢凋亡特性的研究

目的：探讨鼻咽癌细胞系的抗失巢凋亡特性。方法：采用鼻咽癌细胞系CNE2、C666—1、TW03以及正常鼻咽上皮细胞系NP69作为正常对照,用软琼脂实验、悬浮培养等方法诱导失巢凋亡,并用AnnexinV—PI双染色流式细胞计观察凋亡情况。结果：鼻咽癌细胞株CNE-2、C666—1、TW03均具有抵抗失巢凋亡的特性。3种鼻咽癌细胞均能在软琼脂上形成集落,并在培养24h后即可出现,1周内形成的集落速度较快。悬浮培养的鼻咽癌细胞同样出现细胞集落,而NP69细胞未见细胞集落出现。悬浮培养的鼻咽癌细胞在培养48h后凋亡率并没有升高。而NP69细胞则出现了凋亡。结论：鼻咽癌细胞系CNE-2、C666—1、TW03均具有抵抗失巢凋亡的特性。     

EBV 阳性人鼻咽癌细胞外泌体促进淋巴管新生与鼻咽癌淋巴结转移

目的 探讨EB病毒（EBV）阳性鼻咽癌细胞外泌体对淋巴管新生与鼻咽癌淋巴结转移的影响。方法 利用超速离心获得细胞外泌体,对外泌体进行Western blot与纳米颗粒追踪分析（NTA）鉴定。利用Dio染料吞噬实验,验证外泌体可以被淋巴管内皮细胞摄取。离体条件下,分别利用等体积培养基以及20 μg/mL 鼻咽上皮细胞（NP69）、HK1-EBV、C666-1细胞外泌体和除去外泌体的HK1-EBV与C666-1上清蛋白预处理淋巴管内皮细胞,检测淋巴管内皮细胞成管与迁移情况;在体实验,首先建立裸鼠腘窝淋巴结转移模型,负瘤裸鼠被随机分成4组,3只/组。对照组：腘窝处注射生理盐水（30 μL）;NP69外泌体组：10 μg/30 μL NP69外泌体;HK1-EBV除去外泌体上清组：10 μg/30 μL HK1-EBV除去外泌体上清蛋白;HK1-EBV外泌体组：10 μg/30 μL HK1-EBV外泌体。每2 d注射1次,共4次。结果 超速离心获得外泌体富含外泌体特异性蛋白,同时NTA鉴定表明其粒径范围正常;鼻咽癌细胞与NP69外泌体可以被淋巴管内皮细胞摄取;HK1-EBV与C666-1外泌体较空白对照组与NP69外泌体可显著促进淋巴管内皮细胞成管与迁移（P<0.05）,HK1-EBV与C666-1外泌体组与对应除去外泌体上清蛋白组间无显著性差异（P>0.05）;腘窝淋巴结转移实验发现：HK1-EBV外泌体较空白对照组、NP69外泌体以及除去外泌体的HK1-EBV上清蛋白可显著促进鼻咽癌细胞淋巴结转移以及局部淋巴管新生（P<0.05）。结论 EBV阳性鼻咽癌细胞外泌体能促进鼻咽癌淋巴管新生与淋巴结转移。     

EBV-LMP1基因杆状病毒表达载体的构建及其在昆虫细胞中的表达

目的：构建EBV-LMP1基因的杆状病毒重组供体质粒，包装重组LMP1的杆状病毒，感染昆虫细胞进行表达。方法：先将已克隆的LMP1 cDNA与线性化的pFastBACHTb进行连接，使pFASTBACHTb-LMP1与DHl0BAC感受菌进行转座重组，利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid／LMPl克隆，提取Bacmid／LMP1转染昆虫细胞Sf9包装杆状病毒，利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达，通过免疫荧光、SDS-PAGE和Western-blot检测表达情况。结果:获得了重组LMP1的杆状病毒，细胞能表达出与LMP1单抗结合的蛋白，分子量为63kDa左右，细胞可直接分泌LMP1蛋白至上清。结论:LMPl能在昆虫细胞中获得良好表达，为研究肿瘤疫苗及LMPl在EBV致瘤分子机理中的作用奠定了基础。     

鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B的差异蛋白质组学研究

目的:比较不同转移潜能的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)细胞系5-8F和6-10B细胞蛋白质组的差异,筛选NPC转移相关蛋白质.方法:应用二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)技术分离具有相同遗传背景、不同转移潜能的鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达的蛋白质,Western免疫印迹方法验证部分差异蛋白质在2株细胞中的表达水平.结果:建立了5-8F和6-10B细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了65个差异表达的蛋白质点,鉴定了15个非冗余的差异表达蛋白质.Western免疫印迹分析证实了差异蛋白质膜联蛋白A1和14-3-3 protein sigma在5-8F和6-10B细胞中的差异表达水平.结论:15个非冗余的差异表达蛋白质为研究NPC转移机制提供了实验依据.     

miR-483/CREB1轴介导桃叶珊瑚苷抑制髓核细胞胞外基质降解的研究

目的研究miR-483/CREB1轴在桃叶珊瑚苷(aucubin,AU)抑制人退行性髓核(nucleus pulposus,NP)细胞胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解中的功能作用。方法AU处理人退行性NP细胞后,检测细胞活性、ECM相关蛋白及cAMP反应元件结合蛋白1(c AMP responsive element binding protein 1,CREB1)的表达。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)和Western blot检测miR-483表达变化对CREB1丰度的影响;双荧光素酶报告实验(luciferase,LUC)检测miR-483和CREB1-3’-UTR的靶向结合;CREB1过表达载体和(或)miR-483 mimics共转染后,AU处理,检测CREB1及ECM相关蛋白的表达。结果AU可显著增强NP细胞活性(P=0.0004),抑制ECM降解酶基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶-5(a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motif-5,ADAMTS-5)与CREB1的表达,促进胶原蛋白Ⅱ型胶原α1(collagen type II alpha 1 chain,COL2A1)和miR-483的表达(P<0.001)。miR-483过表达可抑制CREB1的表达(P<0.0001),LUC实验表明miR-483可与CREB1-3’-UTR靶向结合。功能实验结果表明CREB1可削弱AU对NP细胞ECM的降解的抑制作用,而miR-483可部分逆转CREB1对AU的抑制作用。结论AU诱导NP细胞表达miR-483,进而抑制CREB1的表达,增强NP细胞的活性,抑制ECM的降解。