RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体，利用脂质粒转染SiHa细胞，用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达，其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h，对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

丹酚酸B配伍丹皮酚对H_2O_2诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA及蛋白表达的影响

目的探讨丹酚酸B配伍丹皮酚对过氧化氢（H2O2）诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA及蛋白表达的影响。方法采用H2O2造成人脐静脉内皮细胞氧化损伤模型,利用SYBR GreenRT-PCR方法检测药物作用内皮细胞后凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA的表达变化,Western blot法检测内皮细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达。结果丹酚酸B配伍丹皮酚能够使损伤内皮细胞中Bcl-2基因mRNA水平上升,而Bax、caspase-3基因的表达降低,与Western blot方法检测蛋白含量的结果较为一致,且数据比较差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论丹酚酸B配伍丹皮酚是通过调节Bcl-2、Bax基因及蛋白的表达,抑制下游分子caspase-3的活化而起到保护血管内皮细胞的作用。     

三氧化二砷诱导人肿瘤细胞凋亡和G2＋M期阻滞但引起人永 …

目的　研究 As2 O3引起肿瘤细胞凋亡和对细胞周期的影响。方法　采用 DNA凝胶电泳 ,流式细胞仪分析、RT- PCR和 Western免疫印迹等技术检测细胞凋亡的发生。结果　由 As2 O3诱导的人肺腺癌 GL C- 82、胃腺癌 MGC- 80 3和 SGC- 790 1、食管癌 Ec10 9、宫颈癌 He L a细胞凋亡前 ,细胞阻滞在 G2 M期 ,上述细胞均表现为对c- myc基因的下行调节 ;但在导致永生化人宫颈上皮 HCE16 /3细胞凋亡之前 ,细胞却被阻滞在 G1期 ,对 c- m yc基因表达无影响。结论　 As2 O3引起细胞凋亡与细胞周期阻滞有关 ,在肿瘤细胞和前恶变的 HCE16 /3细胞中阻滞的时期不同 ,这可能与 c- myc基因表达的改变与否有关     

Induction of SiHa Cells Apoptosis by Nanometer Realgar Suspension and Its Mechanism

The effects of nanometer realgar uterine cervix cancer cell line SiHa cells and suspension on proliferation and apoptosis of human oncogenic genes HPV16E6/E7 were investigated. A ＂micro-jet effiux＂ strategy was used for the preparation of nanometer realgar suspension. SiHa cells were treated with nanometer Realgar suspension in various concentrations （6.25, 12.5, 25 and 50 mg/L） for different durations （12, 24, 48 and 72 h）. The inhibitive effect of nanometer realgar suspension on growth of SiHa cells was detected by MTT method. Special morphological changes of apoptosis were observed by transmission electron microscopy （TEM） and DNA fragments electrophoresis. The apoptotic rate was quantified by flow cytometry （FCM）. The expression of HPV 16E6/E7 mRNA and protein was assayed by RT-PCR and Western blot respectively. The results showed after being treated with 25--50 mg/L nanometer realgar suspension for 48 h, the survival rate of SiHa cells was decreased, and apoptotic rate markedly increased in a time- and concentration-dependent manner. TEM and DNA electrophoresis revealed the special morphological changes of apoptosis. The apoptotic rate of SiHa cells treated with nanometer realgar suspension was significantly higher than in the control group （P〈0.01）, and G0/G1 phase arrest appeared following treatment with nanometer realgar suspension in 25 and 50 mg/L for 48 h. RT-PCR and Western blot assay indicated that nanometer realgar suspension reduced the HPV16E6/E7 gene expression. Nanometer realgar suspension could inhibit the proliferation and induce apoptosis of SiHa cells. The mechanism may be related to the down-regulation of the HPV16E6/E7 gene expression.     

Induction of SiHa Cells Cells Apoptosis by Nanometer Realgar Suspension and Its Mechanism

The effects of nanometer realgar suspension on proliferation and apoptosis of human uterine cervix cancer cell line SiHa cells and oncogenic genes HPV16E6/E7 were investigated. A "micro-jet efflux" strategy was used for the preparation of nanometer realgar suspension. SiHa cells were treated with nanometer Realgar suspension in various concentrations (6.25,12.5,25 and 50mg/L) for different durations (12,24,48 and 72h). The inhibitive effect of nanometer realgar suspension on growth of SiHa cells was detected by MIT method. Special morphological changes of apoptosis were observed by transmission electron microscopy (TEM) and DNA fragments electrophoresis. The apoptotic rate was quantified by flow cytometry (FCM). The expression of HPV16E6/E7 mRNA and protein was assayed by RT-PCR and Western blot respectively. The results showed after being treated with 25-50mg/L nanometer realgar suspension for 48h, the survival rate of SiHa cells was decreased, and apoptotic rate markedly increased in a time- and concentration-dependent manner. TEM and DNA electrophoresis revealed the special morphological changes of apoptosis. The apoptotic rate of SiHa cells treated with nanometer realgar suspension was significantly higher than in the control group (P<0.01), and G0/G1 phase arrest appeared following treatment with nanometer realgar suspension in 25 and 50mg/L for 48h.RT-PCR and Western blot assay indicated that nanometer realgar suspension reduced the HPV16E6/E7 gene expression. Nanometer realgar suspension could inhibit the proliferation and induce apoptosis of SiHa cells. The mechanism may be related to the down-regulation of the HPV16E6/E7 gene expression.     

人乳头瘤病毒16型E5对人宫颈癌SiHa细胞恶性潜能的影响及其机制探讨

目的 通过构建和筛选持续表达HPV16E5的细胞SiHa/16E5,探讨HPV16E5对宫颈癌SiHa细胞的作用及机理.方法 利用pEGFP-C1构建HPV16型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa细胞;利用RT-PCR和Western印迹技术检测转染前后E5和P21基因的mRNA和GFP+E5和P21蛋白的变化;利用MTT法检测SiHa细胞稳定转染后的增殖活性;利用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验分别在体内外验证了SiHa/16E5细胞的致瘤情况.结果 稳定转染携带.HPV16全长E5基因的质粒后,SiHa细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21的表达则明显下调;MTT结果 显示稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高(P<0.05);软琼脂克隆形成结果 示:SiHa/16ES细胞组的可隆形成数为33.4±1.6,与空质粒对照组细胞(15.1±3.1)及未转染组细胞(16.3±2.5)比较差异有统计学意义(P<0.05);裸鼠成瘤实验结果 显示,4个实验组在共20 d的观察中,SiHa/16E5组裸鼠成瘤明显快于其他3个对照组(P<0.05).结论 HPV16 E5可降低宫颈癌SiHa细胞中P21的表达,加强宫颈癌SiHa细胞增殖和成瘤效应.     

下调CD147通过Bcl-2途径诱导宫颈癌细胞SiHa细胞凋亡的研究

目的 研究下调CD147表达后宫颈癌SiHa细胞凋亡变化.方法 设计、合成两对CD147编码基因的反向重复序列,运用瞬间转染方法抑制SiHa中CD147表达,运用RT-PCR、Western blotting方法检测干扰后CD147、Bcl-2、Bim及caspase-3表达改变,流式细胞术检测干扰后肿瘤细胞的凋亡情况.结果 SiRNA sequence 1、2均有效抑制CD147基因表达(P<0.05),伴随着Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),干扰后caspase-3 mRNA、Bim水平升高(P<0.05),活性caspase-3蛋白及Bim水平增高(P<0.05),肿瘤细胞凋亡增加,以细胞早期凋亡改变最为明显(P<0.05).结论 沉默CD147基因表达可部分通过Bcl-2途径诱导SiHa细胞凋亡.     

miR-3685通过靶向CTTN抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭及生长

目的:微小RNA (microRNA,miRNA)通常通过与其靶基因的3′非翻译区（3′UTR）结合而调控肿瘤细胞的恶性行为,目前miR-3685对肿瘤细胞恶性行为的影响鲜有报道,本文旨在探讨miR-3685对宫颈癌细胞恶性行为及其分子机制的影响。方法:生物信息学软件预测miR-3685的靶基因,用EGFP报告系统验证。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测miR-3685和CTTN(cortactin)在人类宫颈癌细胞中的表达,用transwell迁移/侵袭实验、Western blot实验、集落形成实验、细胞周期进程实验分别检测了miR-3685和CTTN对HeLa细胞和SiHa细胞的迁移、侵袭能力、EMT进程、细胞增殖能力及细胞周期进程的影响。结果:与对照组相比,过表达miR-3685可抑制宫颈癌HeLa和SiHa细胞的迁移、侵袭及生长,封闭miR-3685,得到相反的结果。过表达CTTN可促进宫颈癌HeLa和SiHa细胞的迁移、侵袭及生长,EGFP报告系统验证CTTN是miR-3685的直接靶基因（*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001）。结论:miR-3685通过抑制CTTN的表达而抑制宫颈癌HeLa和SiHa细胞的迁移、侵袭及生长。     

三氧化二砷诱导表达带3蛋白膜段结构域K562细胞凋亡作用的研究

目的 探讨三氧化二砷诱导表达带3蛋白膜段结构域K562细胞凋亡的作用。方法 将纯化的表达载体pYDl—mdb3转染K562细胞，Western Blot检定有带3蛋白膜段结构域的表达；通过光学显微镜、DNA电泳和线粒体膜电位的测定，观察三氧化二砷对表达带3蛋白膜段结构域的K562细胞凋亡的影响。结果 表达带3蛋白膜段结构域的K562细胞的上述凋亡特征均比未表达带3蛋白的K562细胞明显。结论 表达带3蛋白膜段结构域的K562细胞对三氧化二砷更敏感。     

黄芩苷联合顺铂体外诱导人肝癌细胞HepG2.0凋亡的实验研究

目的观察黄芩苷联合顺铂是否能诱导HepG2.0细胞凋亡及探讨其对凋亡相关蛋白表达的影响。方法采用体外细胞培养方法,分别用黄芩苷、顺铂及黄芩苷联合顺铂干预HepG2.0细胞。用CCK-8法检测细胞活性;光学显微镜观察HepG2.0细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测HepG2.0细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、c-myc表达的影响。结果光学显微镜下可观察到药物组细胞凋亡的形态改变;各药物组细胞早期凋亡率显著升高;各药物组细胞Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax、c-myc和Caspase-3表达升高。结论黄芩苷、顺铂及黄芩苷联合顺铂均能诱导HepG2.0细胞凋亡,其机制可能通过调控Bcl-2、Bax、Caspase-3、c-myc蛋白的表达有关。     

DC-CIK 细胞诱导宫颈癌细胞凋亡的研究

目的 探讨树突状细胞（DC）与杀伤细胞（CIK）共培养后对宫颈癌细胞（Hela）凋亡的影响。 方法 采集宫颈癌患者外周血,分离外周血单个核细胞（PBMC）,分别诱导DC 和CIK 细胞,并扩增培养, 显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测DC 细胞表面分子CD8、CD40 及CIK 细胞CD3、CD8、CD56。 采用CCK-8 检测DC-CIK 细胞对Hela 细胞存活率的影响,Annexin V /PI 双染检测Hela 细胞的凋亡,逆 转录聚合酶链反应检测Hela 细胞Bax/Bcl-2 mRNA 比值和c-myc mRNA 水平。结果 DC 细胞培养第7 天时CD8 的阳性表达率为21.62%,CD40 的阳性表达率为76.67%。CIK 细胞培养第14 天时CD3、CD8 及 CD56 的阳性表达率分别为86.85%、82.69% 和47.65%。DC-CIK 细胞与Hela 细胞共培养后,Hela 细胞的存 活率下降58.40%。流式细胞仪检测Hela+DC-CIK 细胞凋亡率增加4.12 倍。Hela+DC-CIK 共培养的Hela 组 Bax/Bcl-2 mRNA 比值为Hela 组的（3.49±0.08）倍（P <0.05）,c-myc mRNA 水平提高60.72%（P <0.05）。 结论 该实验成功构建DC-CIK 共培养体系,初步验证DC-CIK 可能通过调控Bax /Bcl -2 及c -myc 基因的 表达,诱导Hela 细胞凋亡。     

芪苈强心胶囊对H2O2诱导的H9C2大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的观察芪苈强心胶囊对H2O2诱导的H9C2大鼠心肌细胞凋亡的影响,探讨芪苈强心胶囊抗心力衰竭的作用机制。方法H9C2大鼠心肌细胞分为正常对照组、模型组、芪苈强心组,后2组采用100μmol/L H2O2处理6 h造成心肌细胞损伤模型,芪苈强心组加入含药血清,3组继续培养12、24、48 h,MTT法测定细胞增殖率。各组给药孵育48 h后,收集细胞,FCM方法测定细胞凋亡率,RT-PCR和Western blot法检测Caspase-3、Bcl-2、Bax、Fas/FasL mRNA和蛋白的表达。结果与模型组比较,芪苈强心组能增加H9C2细胞增殖活性,RT-RCR和Western blot方法结果显示芪苈强心组细胞凋亡率、Caspase-3、Bax、Fas、FasL表达明显下降,Bcl-2、Bcl-2/Bax明显上升。结论芪苈强心胶囊能下调Caspase-3、Fas/FasL表达,调节Bcl-2/Bax平衡,抑制心肌细胞凋亡,对心肌细胞起到一定的保护作用。     

原花青素B2保护血管内皮细胞延缓凋亡及机制研究

目的 以H2O2诱导人内皮细胞凋亡为模型,观察原花青素B2 (GSPB2)延缓人内皮细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 用0.5 mmol H2O2预处理细胞,分别加入不同浓度的GSPB2(5.0、10.0、20.0 μmol/L)保护细胞,TUNEL法检测细胞凋亡;Western blotting检测凋亡相关分子Caspase-3、Bax、Bcl-2以及影响凋亡的相关分子PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达;Transwell小室检测各组细胞迁移情况.结果 0.5 mmol H2O2致人内皮细胞凋亡明显增加(P＜0.01),GSPB2能明显减轻H2O2所致的人内皮细胞凋亡(P＜0.05),10 μmol/mL的GSPB2就能接近恢复到H2O2未处理的对照组水平.进一步研究发现:Caspase-3、bax蛋白表达上调,Bcl-2表达下调;PI3K、p-Akt、Akt表达上调.结论 不同浓度的GSPB2对H2O2诱导的血管内皮细胞具有保护作用,而且表现为浓度依赖性和时间依赖性,其机制与相关分子PI3K、p-Akt、Akt有关.     

血管抑制素-2通过调控上皮细胞间质化促进宫颈癌细胞的增殖和转移

目的 探讨血管抑制素-2（VASH2）能否促进宫颈癌细胞在体外的增殖和转移及其可能的分子机制。方法 在外源性过表达和干扰内源性flotillin-1表达的宫颈癌细胞中,通过公共数据库结合RNA-seq挖掘分析差异表达基因;在宫颈正常上皮细胞（HcerEpic细胞）和宫颈癌细胞（HeLa、C-33A、Ca ski、SiHa和MS751）以及不同淋巴结转移状态的新鲜宫颈癌组织中检测VASH2的表达;运用慢病毒稳定表达载体构建外源性过表达VASH2和干扰内源性VASH2表达的宫颈癌细胞及对照细胞,并检测其增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成的情况;在上述细胞模型中检测上皮细胞间质化（EMT）过程关键分子及TGF-β的表达水平。结果 RNA-seq发现在外源性过表达flotillin-1的宫颈癌细胞中VASH2的表达上调（P<0.05）,而在抑制内源性flotillin-1表达的细胞中VASH2表达下调（P<0.05）,并在公共数据库中证实VASH2在有淋巴结转移的宫颈癌组织中相对于无淋巴结转移的癌组织呈高表达（P<0.01）。相对于HcerEpic细胞和淋巴结未转移的宫颈癌组织,VASH2在Ca Ski、SiHa、MS751细胞和有淋巴结转移的宫颈癌组织中表达上调（P<0.05）;相对于对照细胞,外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成能力增强,而抑制内源性VASH2表达的宫颈癌细胞上述能力则受到抑制（P<0.05）;相对于对照细胞,外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞中EMT过程的关键分子E-cadherin下调,N-cadherin、Vimentin和VEGF-C上调,而抑制内源性 VASH2 表达的宫颈癌细胞中 E-cadherin 上调,N-cadherin、Vimentin 和 VEGF-C 下调（P<0.05）;外源性过表达VASH2的宫颈癌细胞中TGF-β的mRNA表达水平上调,而抑制内源性VASH2表达的宫颈癌细胞中TGF-β的mRNA表达水平下调（P<0.001）。结论 flotillin-1可能通过下游靶基因VASH2参与 TGF-β信号通路诱导EMT过程在体外促进宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和淋巴管形成。     

宫颈癌细胞系中HPV 感染与GRP78、JNK 及 CHOP 表达的相关性分析

目的 探讨宫颈癌细胞系中HPV（HPV）感染状态与内质网应激相关蛋白表达之间的相关性。 方法 采用免疫组织化学法、Western blot、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测GRP78、JNK 及 CHOP 蛋白和mRNA 在HPV16（+）Siha、HPV18（+）Hela 及HPV（-）C33a 3 种宫颈癌细胞系中的表达 水平,并采用统计学分析其表达的差异性。结果 免疫组织化学法结果显示,GRP78 蛋白在高危型HPV16（+） Siha 和HPV18（+）Hela 的表达高于HPV（-）C33a（P <0.05）,内质网应激相关蛋白JNK、CHOP 在HPV16 （+）Siha 和HPV18（+）Hela 的表达高于HPV（-）C33a（P <0.05）。RT-PCR 及Western blot 结果显示, GRP78、JNK 及CHOP mRNA 及蛋白表达在HPV16（+）Siha 和HPV18（+）Hela 细胞株中高于HPV（-） C33a 细胞株（P <0.05）。结论 宫颈癌中GRP78 和内质网应激相关蛋白JNK、CHOP 的表达与HPV 亚型相关, 内质网应激相关蛋白可能参与了宫颈癌的发生与发展。     

过表达骨桥蛋白对游离脂肪酸诱导RIN m5f细胞凋亡的保护作用

目的通过构建骨桥蛋白过表达细胞模型,研究骨桥蛋白对游离脂肪酸诱导RINm5f细胞凋亡的保护作用。方法构建骨桥蛋白真核表达质粒,转染细胞,游离脂肪酸诱导细胞凋亡,检测游离脂肪酸作用前后对照组及过表达组骨桥蛋白及其mRNA水平,细胞凋亡水平,凋亡相关基因水平,探究骨桥蛋白对游离脂肪酸诱导的RINm5f细胞凋亡的作用。结果游离脂肪酸作用后,骨桥蛋白表达增加,过表达组较对照组,游离脂肪酸作用后细胞凋亡率降低,凋亡相关基因BAX,Bcl-2表达水平明显降低。结论骨桥蛋白对游离脂肪酸诱导的RINm5f细胞凋亡具有有效的保护作用。     

miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响

目的：研究 miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭、迁移能力的影响及其可能机制。方法将 miR-98mimics、mimics-NC、miR-98inhibitor、inhibitor-NC 瞬时转入肝癌 HepG2细胞内,应用噻唑盐( MTT)法、流式细胞仪、Tr-answell 小室实验检测 miR-98对肝癌 HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响,进一步用 Western blot 法检测各组 Bcl-2蛋白的表达水平。结果 MTT 实验表明 miR-98过表达后,肝癌细胞的增殖能力明显低于对照组;Annexin V-FITC / PI 凋亡实验证实上调 miR-98表达后,细胞的凋亡率较对照组升高;Transwell 小室实验表明上调 miR-98可使肝癌细胞的侵袭、迁移能力减弱。而当 miR-98被抑制后,肝癌HepG2细胞的增殖及侵袭、迁移能力则明显增强,凋亡率则下降。 Western blot 实验检测发现 miR-98过表达后,Bcl-2的表达降低。结论 miR-98可能在肝癌的发生、发展中发挥着抑癌基因的作用;miR-98可能通过下调 Bcl-2的表达,促进肝癌 HepG2细胞凋亡。     

白花蛇舌草通过JAK2/STAT3通路途经诱导膀胱癌T24细胞凋亡

目的：研究白花蛇舌草对膀胱癌T24细胞凋亡的影响及其潜在机制。方法 MTT法检测不同浓度白花蛇舌草对T24增殖的抑制作用,AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测细胞中JAK2、STAT3、Bax、Caspase-3和Bcl-2的表达情况。结果白花蛇舌草明显抑制膀胱癌T24细胞的增殖同时诱导其凋亡,且作用强度随着浓度的增加而增加。Western blot检测证实白花蛇舌草能够显著抑制细胞中JAK2、STAT3和Bcl-2表达,上调Bax和Caspase-3表达。结论白花蛇舌草能够抑制膀胱癌细胞T24增殖,促进其凋亡,可能与抑制JAK2/STAT3通路有关。     

Preliminary study of the in vitro growth inhibition of human bladder cancer cell line BIU-87 by arsenic trioxide

Arsenic trioxide (As,O, ) is the major effectivecomponent of Pishuang. Because of its toxic and sideeffects, it was not widely used in clinic for a lOng period. In addition, it was believed that arsenic compound could result in chromosome abnormality, sis…