人乳头状瘤病毒16型多肽疫苗的制备及体内外效应观察

目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV)16型多肽疫苗的制备,并观察HPV16多肽疫苗的体内外效应.方法 (1)针对抗原加工相关转运子(TAP)设计HPV16 E7蛋白的主要组织相容性复合物Ⅰ类分子(MHC-I)的抗原结合表位,利用生物信息学分析平台筛选出一致性较高、特异性及亲和力较强的HPV16 E7多肽作为研究对象制备HPV16多肽疫苗用于以下研究,本研究共筛选出3段多肽,分别命名为E7Pa、E7Pb、E7Pc.(2)C57BL/6小鼠注射鼠肺上皮细胞株TC-1细胞(为鼠源性的HPV16阳性的肿瘤细胞株)后,采用等额抽取的随机方法分为5组,ETPa+二核苷胞嘧啶(CpG)、E7Pb+CpG、E7Pc+CpG[均为实验组,分别加入终浓度为50μg/ml的E7Pa、E7Pb、E7Pc和终浓度为12 mg/L的刀豆蛋白(ConA)]、CpG(为阳性对照,加入终浓度为12 mg/L 的Con A)和空白对照组(不做任何处理).采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组作用不同时间后小鼠脾T淋巴细胞的体外增殖效应,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测小鼠脾T淋巴细胞在不同效靶比下的体外细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性,实时荧光定量RT-PER技术检测小鼠肿瘤组织中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)mRNA的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2的表达水平,通过定期测量比较各组小鼠接种HPV16多肽疫苗后体内肿瘤体积的变化.结果 (1)本研究筛选出了一致性较高、特异性及亲和力较强的3段HPV16 E7多肽作为研究对象制备HPV16多肽疫苗,分别命名为E7Pa、E7Pb、E7Pc.(2)MTT比色法检测显示,在接种疫苗24、48、72、96 h后,以E7Pa+CpG组的增殖效应最明显,其细胞增殖率分别为(131±32)%、(302±15)%、(552±28)%、(731±24)%,明显高于空白对照组的(72±15)%、(120±57)%、(176±41)%、(288±29)%(P<0.01);E7Pb+CpG、ETPc+CpG、CpG组的细胞增殖率也均明显高于空白对照组(P<0.05);但E7Pb+CpG、E7Pc+CpG、CpG组间比较,差异则无统计学意义(P>0.05).LDH释放法榆测显示,效靶比为100:1时,E7Pa+CpG、E7Pb+CpG、E7Pc+CpG、CpG和空白对照组CTL 活性分别为(85.9±3.0)%、(55.9±2.5)%、(60.2±1.5)%、(41.0±1.7)%和(4.1±1.0)%,E7Pa+CpG组与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);E7Pb+CpG、E7Pc+CpG、CpG组分别与空白对照组比较,差异也有统计学意义(P<0.05);但E7Pb+CpG、E7Pc+CpG、CpG组间比较,差异则无统计学意义(P>0.05).在肿瘤组织及外周血中,小鼠IFN-γ、IL-2的表达水平,E7Pa+CpG组与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);E7Pb+CpG、E7Pc+CpG和CpG组分别与空白对照组比较,差异也均有统计学意义(P<0.05);但E7Pb+CpG、E7Pc+CpG、CpG组问比较,差异则无统计学意义(P>0.05).小鼠体内的肿瘤体积,各实验组肿瘤生长均明显被抑制,接种后第60大,E7Pa+CpG组与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);E7Pb+CpG、E7Pc+CpG和CpG组分别与空白对照组比较,差异也均有统计学意义(P<0.05);但 E7Pb+CpG、E7Pc+CpG、CpG组间比较,差异则无统计学意义(P>0.05).结论 在动物模型中,针对TAP筛选的HPV16 E7多肽联合CpG制备的HPV16多肽疫苗,可以有效治疗HPV16 E7阳性的肿瘤.     

宫颈癌的相关免疫治疗及进展

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁女性健康。高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）持续感染是宫颈癌的主要危险因素。近年来,HPV疫苗在宫颈癌预防方面取得了良好的效果,免疫治疗也成为了宫颈癌治疗的新模式,尤其对于手术、放化疗效果不佳和术后转移及晚期复发的患者,免疫治疗尤为重要。免疫治疗的策略主要包括免疫检查点抑制剂、疫苗治疗、树突状细胞免疫疗法和过继细胞免疫疗法。目前,相关的免疫疗法在宫颈癌及其癌前病变治疗的研究中均取得了不错的疗效。综述宫颈癌中的免疫治疗进展,并对今后的研究方向做出展望,从而为宫颈癌的临床治疗和基础研究提供依据。     

髓源性抑制细胞与促炎因子在卵巢恶性肿瘤中的研究进展

髓源性抑制细胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）是一类具有显著免疫抑制活性的异质细胞群,包括处于不同分化阶段的未成熟的粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞等。MDSCs可抑制CD4+、CD8+ T细胞介导的适应性免疫应答,介导肿瘤免疫逃逸而促进肿瘤的生长和转移。促炎因子是一类主要由免疫细胞生成的具有许多强大生物学效应的内源性多肽,可介导多种免疫反应。MDSCs与促炎因子在卵巢癌中的分子信号传递及其机制仍不完全清楚,目前的研究提示部分促炎因子可诱导MDSCs扩增,进而促进肿瘤生长及发展。本文就MDSCs及相关促炎因子在卵巢恶性肿瘤中发生、发展和治疗的研究进行综述,以期更全面揭示MDSCs的作用机制,为探讨新的治疗方法提供理论基础。     

小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.     

携带小鼠HVEM的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定

目的 克隆小鼠疱疹病毒侵入介体(HVEM)基因,构建其重组腺相关病毒载体,鉴定目的 基因在真核细胞中表达.方法 用RT-PCR法从小鼠脾脏淋巴细胞克隆出全长HVEM基因,构建携带HVEM基因的穿梭质粒pAAV-IRES-HVEM-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC及pAAV-Helper,利用磷酸钙共沉淀法将穿梭质粒共转染入AAV-293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒rAAV-HVEM.用氯仿-PEG8000法纯化病毒,实时荧光定量PCR测病毒滴度.RT-PCR检测rAAV-HVEM在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达情况.结果 成功构建组装重组小鼠HVEM腺相关病毒,纯化后病毒滴度为5×1010 v·g/mL,且在CHO 转导细胞中能有效表达目的 基因.结论 构建的重组腺相关病毒载体rAAV-HVEM 为组织工程相关细胞转基因构建及临床应用提供先进的载体系统,为今后进一步研究HVEM的功能及其在部分疾病基因免疫治疗中的应用奠定基础.     

宫颈癌患者外周血髓源性抑制细胞的比例及其临床意义

目的：比较分析髓源性抑制细胞（myeloid‐derived suppressor cells ,MDSCs）在健康人、宫颈上皮内瘤变患者、宫颈癌患者及其术后外周血中的比例,初步探讨其临床意义。方法采用流式细胞术检测36例宫颈癌患者、52例宫颈上皮内瘤变患者及20例健康志愿者外周血中MDSCs、调节性T细胞（Treg）的比例。检测20例宫颈癌患者术前术后外周血中MDSCs、Treg的比例及MDSCs产生的精氨酸酶和一氧化氮（NO）的变化情况。结果宫颈癌组外周血中MD‐SCs、Treg的比例最高,分别为[（3.85±0.85）％,（7.82±1.04）％],其次是宫颈上皮内瘤变组[（1.52±0.53）％,（3.32±0.48）％],健康对照组最低[（0.61±0.17）％,（2.02±0.26）％],各组间差异均有统计学意义（均 P＜0.05）;手术后,患者外周血中MDSCs、Treg的比例明显下降,MDSCs产生的精氨酸酶和NO下降,与术前比较差异均有统计学意义（均 P＜0.05）。结论外周血MDSCs比例的升高可能与肿瘤免疫功能低下及宫颈癌的发生发展密切相关。     

BTLA-HVEM通路阻断对树突状细胞功能影响的体内外研究

目的 探讨阻断BTLA-HVEM(B/T淋巴细胞弱化因子疱疹病毒进入介质)通路对树突状细胞功能的影响和相关免疫学机制.方法 构建小鼠BTLA胞外功能区的真核表达载体psBTLA,转染CHO细胞;HSP70-TC-1肿瘤抗原肽刺激小鼠骨髓来源DCs,流式细胞仪检测处理后DCs表面BTLA、HVEM的表达,同时给予转染了psBTLA质粒的CHO细胞的培养上清处理后,检测DCs表面B7-1的表达,ELISA检测上清中IL-12的分泌;处理后的DCs刺激脾细胞,检测淋巴细胞增殖和细胞因子分泌;检测psBTLA体内转染对宫颈癌细胞系TC-1成瘤小鼠DCs表达B7-1和肿瘤生长的影响.结果 成功构建小鼠BTLA胞外段的真核表达载体psBTLA,获得了稳定转染psBTLA的CHO细胞,在其培养上清检测到BTLA胞外段(sBTLA)的表达.DCs经抗原肽刺激后BTLA、HVEM表达均上调,加入含sBTLA的上清处理后上调B7-1,上清中分泌的IL-12增加,与脾细胞共培养时促进细胞增殖和IL-2、IFN-γ的分泌;体内基因转染psBTLA促进DCs表达B7-1以及抑制肿瘤生长.结论 通过sBTLA阻断BTLA-HVEM共抑制通路,可以进一步促进DCs的功能,更好地激活淋巴细胞,促进抗肿瘤免疫应答.     

sPD-1和4-1BBL体内联合表达对小鼠实验性肝癌的治疗作用

目的探讨sPD-1和4-1BBL联合治疗肿瘤的效应和相关的免疫学机制。方法以H22肝癌细胞接种于BALB／c小鼠右后腿肌肉内，建立小鼠肿瘤模型；采用4-1BBL和可溶性PD-1（sPD-1）真核表达质粒通过肌肉转染进行基因治疗；检测小鼠肿瘤生长情况，并检测转染基因及肿瘤微环境中免疫调控相关基因的表达，检测肿瘤组织中的淋巴细胞数量的变化。结果单独转染4-1BBL基因或sPD-1基因均显示出抗肿瘤作用，而联合治疗对肿瘤生长抑制作用更为明显，该组抑瘤率高达92．3％（以pcDNA3．1组为对照），显著高于4-1BBL组（78％）、sPD-1组（70．2％）。联合治疗不仅使TGF-β、IL-10的表达下调，而且在治疗后期更有效地促进IFN-γ和IL-2基因表达上调，且使瘤组织中CD8^＋T淋巴细胞数量较其他各组显著增加。结论4-1BBL和sPD-1联合治疗可使肿瘤微环境中的免疫相关基因表达更有利于抗肿瘤免疫应答，增强肿瘤免疫治疗效果。     

宫腔镜检查对反复胚胎种植失败者再次种植妊娠率的影响

目的:探讨宫腔镜检查对反复胚胎种植失败(RIF)患者再次胚胎种植的临床妊娠率(CPR)的影响。方法:回顾性分析RIF患者281例的临床资料,再次种植前接受宫腔镜检查为A组(210例),其中宫腔镜下无异常发现为A1组(144例),宫腔镜下有异常发现为A2组(66例),再次种植前未接受宫腔镜检查为B组(71例)。宫腔镜手术中对宫腔异常者予以处理,宫腔无异常者仅行内膜搔刮。3组患者均再次行胚胎种植,比较3组再次种植的CPR。结果:A1组CPR为25.7%,A2组CPR为30.3%,B组再次种植CPR为11.3%,A1组、A2组的CPR均高于B组(P0.05),A1组与A2组的CPR比较,差异无统计学意义(P0.05)。A2组中子宫内膜息肉(22例)、宫腔粘连(12例)患者的再次种植CPR(45.5%,41.7%)明显高于B组(11.3%),差异有统计学意义(P0.05);宫腔偏小(29例)患者的再次种植CPR(17.2%)与B组比较,差异无统计学意义(P0.05);宫腔镜下发现黏膜下子宫肌瘤、鞍状子宫、单角子宫各1例,宫腔镜术后再次胚胎种植均未妊娠。结论:宫腔镜下发现并处理宫腔异常,特别是子宫内膜息肉与宫腔粘连的治疗能提高再次种植的CPR;宫腔镜无异常发现,仅行内膜搔刮亦能提高再次种植的CPR。     

人乳头瘤病毒16型E5对人宫颈癌SiHa细胞恶性潜能的影响及其机制探讨

目的 通过构建和筛选持续表达HPV16E5的细胞SiHa/16E5,探讨HPV16E5对宫颈癌SiHa细胞的作用及机理.方法 利用pEGFP-C1构建HPV16型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa细胞;利用RT-PCR和Western印迹技术检测转染前后E5和P21基因的mRNA和GFP+E5和P21蛋白的变化;利用MTT法检测SiHa细胞稳定转染后的增殖活性;利用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验分别在体内外验证了SiHa/16E5细胞的致瘤情况.结果 稳定转染携带.HPV16全长E5基因的质粒后,SiHa细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21的表达则明显下调;MTT结果 显示稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高(P<0.05);软琼脂克隆形成结果 示:SiHa/16ES细胞组的可隆形成数为33.4±1.6,与空质粒对照组细胞(15.1±3.1)及未转染组细胞(16.3±2.5)比较差异有统计学意义(P<0.05);裸鼠成瘤实验结果 显示,4个实验组在共20 d的观察中,SiHa/16E5组裸鼠成瘤明显快于其他3个对照组(P<0.05).结论 HPV16 E5可降低宫颈癌SiHa细胞中P21的表达,加强宫颈癌SiHa细胞增殖和成瘤效应.