SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞,构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养,以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况;应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长,长期传代(50代)仍有很强的增殖能力,形态呈现多角形和三角形,GAG和胶原染色均呈阳性。结论构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

松质骨骨基质明胶复合软骨细胞构建组织工程软骨

目的 观察软骨细胞在同种异体松质骨骨基质明胶(BMG)上的生长、增殖和分化,探讨用松质骨BMG与软骨细胞体外构建组织工程软骨的效果.方法 分离1月龄兔关节软骨细胞,扩增后种植在松质骨BMG上体外构建组织工程软骨.于1、2、4、6周取材进行组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学及透射电镜观察.结果 软骨细胞在BMG上生长良好,分泌蛋白聚糖和胶原.随培养时间延长,细胞增殖,松质骨BMG空隙内细胞数量增多,软骨陷窝形成,基质分泌增强.培养6周时软骨细胞在BMG表面及孔隙内形成软骨样组织,免疫组织化学染色显示细胞周围基质富含Ⅱ型胶原,分布均匀:透射电镜显示软骨细胞超微结构正常,细胞周围有大量基质产生.结论 同种异体松质骨BMG可以促进软骨细胞的生长增殖,维持软骨细胞的分化表型;在体外成功构建了组织工程软骨,它是一种较好的软骨组织工程支架材料.

Abstract：

Objective To evaluate the use of cancellous bone matrix gelatin (BMG) combined with chondrocytes in constructing tissue-engineered cartilage by observing the growth, proliferation and differentiation of chondrocytes on allogeneic cancellous BMG. Methods The articular chondrocytes isolated from a 1-month-old rabbit were multiplied to a monolayer and seeded onto cancellous BMG to construct tissue-engineered cartilage in vitro during a period of 6 weeks. Samples were taken from the construct after 1, 2,4, and 6 weeks of culture and evaluated by histology, immunohistochemistry and transmission electron microscopy (TEM). Results The chondrocytes excreted matrix proteoglycan and collagen on cancellous BMG. With the prolongation of the culture time, the cells proliferated in the construct and the cells in the lacunae increased. Numerous chondrocytes were present the central region of the cancellous BMG and surrounded by extracellular matrix. By 6 weeks of culture, the BMG was covered with 15-20 layers of chondrocytes and cartilaginous tissue occurred in the pores throughout the cancellous BMG. Immunohistochemical staining showed rich and evenly distributed type Ⅱ collagen around the chondrocytes, and TEM revealed an ultrastructure of the chondrocyte similar to that of native chondroctyes, with abundant extracellular matrix produced around the cells. Conclusion Tissue-engineered cartilage can be constructed in vitro using allogeneic cancellous BMG combined with chondrocytes. Allogeneic cancellous BMG serves as a good scaffold material for tissue-engineered cartilage to promote the growth and proliferation of the seeded chondrocytes and allows maintenance of the differentiation phenotype of the cells.     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种骨胶原基质支架体外构建组织工程软骨

目的探讨复合应用胶原凝胶和骨胶原基质（BCM）支架作为软骨细胞载体体外构建组织工程软骨的有效性和可行性.方法将胶原凝胶包埋的软骨细胞接种BCM支架并在体外培养,应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察软骨细胞的粘附、生长和增殖情况,培养14d,行HE、TB（甲苯胺蓝）染色观察软骨组织形成情况.结果软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好,体外培养14d能形成较成熟的软骨组织.结论胶原凝胶复合BCM支架可作为软骨细胞的载体体外构建组织工程软骨.     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

关节软骨细胞体外培养及生物学特性的实验研究

目的:探讨关节软骨细胞培养方法及其生物学特征。方法:从4周龄新西兰乳兔关节分离静置培养软骨细胞,倒置显微镜下观察原代及传代细胞形态变化,并计数绘制生长曲线。用番红-O,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法观察蛋白多糖,碱性糖胺聚糖(GAGs),Ⅱ型胶原的分泌情况,用PCR鉴定Ⅱ型胶原,Aggrecan基因的表达。结果:成功建立兔关节软骨细胞体外培养实验方法。形态学及免疫化学染色显示体外培养3代以内的软骨细胞可保持表型稳定而3代后软骨细胞呈现增殖缓慢及衰老现象。结论:本实验建立的体外培养关节软骨细胞方法简单可行,3代内的兔软骨细胞表型稳定且生物学活性较高,具备可用于实验研究的能力。     

永生化软骨细胞体外快速扩增的实验研究

目的　探讨获取大量软骨组织工程种子细胞的方法和技术。方法　通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选、挑选阳性克隆在微载体 RCCS内快速扩增永生化软骨细胞。观测RCCS中微载体培养永生化软骨细胞的生长情况和检测细胞代谢率 ,进行Ⅱ型胶原免疫组化染色 ,并与常规培养方法进行比较。结果　永生化软骨细胞在微载体 RCCS中生长迅速、细胞代谢率高、倍增时间缩短 (P <0 0 1)。在培养第 8天 ,细胞数量可达最初接种的 95倍 (P <0 0 1)。结论　联合应用微载体和RCCS培养技术 ,能够在体外快速、大量扩增永生化软骨细胞     

兔关节软骨细胞在藻酸盐凝胶中体外培养

目的 观察体外藻酸盐凝胶三维立体支架培养软骨细胞的生长情况.方法 从2周龄兔关节表面切取软骨,经酶消化获得软骨细胞.在单层培养条件下增殖至P2代,转入藻酸盐凝胶中进行三维培养.通过倒置显微镜观察、DNA含量的测定、细胞组织化学及免疫组化染色,了解软骨细胞生长情况.结果 在藻酸盐凝胶中软骨细胞活性良好,增殖活跃,Ⅱ型胶原免疫组化和藩红O染色均呈阳性.结论 在该培养体系中有利于软骨细胞的表型维持.     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

不同培养时间软骨细胞的生物学特性

目的 探讨软骨细胞在体外不同培养时间的生物学特性。方法 把罗骨细胞置盖玻片上２,观察不同培养时间细胞的形态学变化和增殖能力,应用阿新蓝和三色染色,观察细胞在培养过程中酸性粘多糖（ＧＡＧ）、和胶原分泌情况。结果 软骨细胞经体外单层培养,传代４～５代后,细胞形态逐渐由多角形变为俊形,基质分泌减少,ＧＡＧ和胶原染色变浅。结论 软骨细胞在体外培养３周左右是作为有组织工程的最佳种子细胞。     

利用PLGA细胞支架再生人关节软骨的实验研究

目的：研究人关节软骨细胞在PLCA三维支架上的贴附和生长情况，利用组织工程技术培养工程化关节软骨。方法：制作PLGA三维细胞支架。分离培养成人关节软骨细胞，体外扩增后种植到PLGA支架中。在体外和裸鼠体内分别培养软骨细胞一支架复合物，分期终止培养，进行组织学染色、扫描电镜、Ⅱ型胶原免疫组织化学及cDNA探针原位杂交检测。结果：体外培养发现，软骨细胞支架材料内贴附生长良好，长期培养仍保持软骨细胞特性，棵鼠体内培养8周后可形成软骨样组织。结论：PLGA三维支架适合软骨细胞贴附生长和分泌软骨外基质，可作为软骨组织工程的细胞载体。利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化关节软骨。     

兔关节软骨细胞的分离培养及生物学特征

目的 探讨兔关节软骨细胞分离培养的方法和生物学特性。方法 从4周龄新西兰白兔关节分离培养软骨细胞，倒置显微镜下观察原代及传代培养的细胞形态学变化，并计数绘制生长曲线。测定细胞冻存复苏后的存活率。用甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法了解葡萄糖胺多糖（GAGs），Ⅱ型胶原的合成情况并鉴定细胞。结果 成功建立体外培养兔关节软骨细胞的实验方法。原代培养的软骨细胞呈多角形，传代3次后出现反分化。形态学、免疫化学染色显示细胞培养3代以内可以保持表型的稳定，冷冻复苏存活率为92％。结论 本文建立的体外培养关节软骨细胞的方法简单可行。体外培养的兔软骨细胞表型能保持3代稳定，具有良好的生物学活性，可用于实验研究，可经深低温冷冻保存。     

氟浓度对体外培养大鼠软骨细胞糖胺多糖和Ⅱ型胶原分泌的影响

目的 探讨氟浓度对体外培养软骨细胞糖胺多糖（GAG）和Ⅱ型胶原分泌的影响.方法 取2月龄雌性SD大鼠下肢髋关节及膝关节软骨,分离、培养出软骨细胞后,接种于细胞培养瓶,经鉴定后,分为空白对照组和NaF受试组（6.25 μmol/ml、12.50μmol/ml、25.00 tmol/ml、50.00 μmol/ml和100.00 μmol/ml）,孵育6d后,分别进行GAG含量测定、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果 NaF受试6d后,大鼠软骨细胞培养液GAG含量各组无显著性差异（P＞0.05）;阿利新蓝染色显示,大鼠软骨细胞内的糖原异染颗粒亦无明显差异;Ⅱ型胶原免疫组化染色则显示,不同剂量NaF可引起对软骨细胞外Ⅱ型胶原染色积分随剂量的升高逐渐上升（P＜0.05）.结论 NaF对大鼠软骨细胞GAG分泌可能无影响,但可能影响Ⅱ型胶原的分泌.     

关节软骨损伤组织工程修复的实验研究

目的：（1）研究不同体外培养时间软骨的生物学特性，探讨运用于软骨组织工程中软骨种子细胞的最适宜培养时间和条件。（2）应用组织工程技术探讨运用自体关节软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（3）应用组织工程技术探讨应用同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（4）研究修复关节软骨缺损的软骨细胞来源。方法：（1）取新西兰兔关节软骨细胞体外培养，观察软骨细胞的形态学变化，生长曲线，酸性粘多糖及胶原分泌情况。（2）建立关节软骨缺损模型，应用自体关节软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（3）应用同种异体软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（4）应用3H－TdR放射自显影方法，确定修复关节软骨缺损的细胞来源。结果：（1）体外培养第四代软骨细胞的增殖能力达到高峰，而第二代软骨细胞分泌基质能力最强。（2）自体或同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损，12周后缺损表面较平滑，与正常软骨界面愈合较好，MASSON三色染色显示胶原分布已较均匀， 骨细胞呈柱状排列，II型胶原在细胞周围阳性表达，而空白对照和材料对照组未见明显修复。（3）3H－TdR放射自显影方法证实修复软骨组织的细胞来源于体外移植细胞，软骨细胞植入体内早期仍进行有丝分裂，而在中后期软骨细胞以分泌基质为主，植入的细胞与周围软骨细胞间存在物质交换。结论：（1）软骨细胞在体外培养2－3周左右是作为软骨组织工程种子细胞的最佳时机。（2）自体或同种异体组织工程化软骨是修复关节软骨缺损的较好方法。（3）组织工程化软骨修复关节软骨缺损的细胞来源于体外移植的软骨细胞。     

CPPf/PLLA支架负载人半月板纤维软骨细胞的体外实验研究

目的探讨聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPPf／PLLA）支架负载人半月板纤维软骨细胞的有效性和可行性。方法将人半月板纤维软骨细胞接种CPPf／PLIA支架并在体外培养，应用倒置相差显微镜和扫描电镜观察纤维软骨细胞的粘附、生长和增殖情况，培养14d，行HE、TB（甲苯胺蓝）及Ⅰ型胶原免疫组化染色观察纤维软骨组织形成情况。结果纤维软骨细胞在支架上粘附、生长和增殖良好，体外培养14d能形成较成熟的纤维软骨组织。结论CPPf／PLLA支架具有良好的细胞相容性，可作为负载人纤维软骨细胞的载体。     

快速扩增羊软骨细胞的生物学特性观察

目的:观察在旋转生物反应器内微载体技术快速扩增的羊软骨细胞生物学特性。方法:将培养的羊软骨细胞应用Cytodex-3微载体在旋转生物反应器(RCSS)内,进行动态培养,应用倒置显微镜和扫描电子显微镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察,对收获的软骨细胞进行细胞计数、蕃红花“O”染色、Ⅱ型胶原的细胞免疫组化分析。结果:关节软骨细胞于1 d内贴附于Cytodex-3微载体表面,到12 d,细胞密度可达最初接种的15~17倍,经蕃红花“O”染色为阳性、Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。结论:利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞。     

大鼠腰椎终板软骨细胞的培养及其生物学性状的研究

目的通过对大鼠腰椎终板软骨细胞的培养，观察细胞的生物学性状，探讨终板软骨细胞的生物学行为厦影响因素。方法取犬鼠腰椎终板软骨细胞，在加10％灭活胎牛血清的F12-DMEM培养液中培养，建立体外终板软骨细胞培养模型。采取绘制细胞生长曲线、HE、甲苯胺蓝染色厦免疫组织化学染色等方法，对细胞形态、活力、生长情况厦软骨细胞的表型进行鉴定。结果终板软骨细胞可以在体外培养，但细胞活力随着培养时间的延长厦传代逐渐降低；终板软骨细胞的生长情况厦细胞表型类似于关节软骨，有Ⅱ型胶原和aggrecan的表达。结论体外成功培齐了大鼠腰椎终板软骨细胞，为进一步研究终板软骨在椎间盘退变中的作用打下了基础。     

转化人关节软骨细胞的Ⅱ型胶原表型诱导

目的 用离心管聚集体培养（Aggregate culture)诱导转化人关节细胞的Ⅱ型胶原。方法 将体外长期培养的第30，40，50代转化软骨细胞消化后进行离心管培养，比较细胞在单层培养，离心管聚集体培养，以及在普通培养基，RAI诱导培养基下[2型骨形态发生蛋白（BMP－2）＋抗坏血酸盐（Ascorbate) 胰岛素（insulin)]，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原的表达和胞外基质发生情况。结果 在单层培养条件下，转化软骨细胞只表达Ⅰ型胶原，而在BAI诱导培养基及离心管聚集体培养下转化软有细胞表达的Ⅱ型胶原和大量胞外基质。结论 离心管聚集体培养是诱导转化软骨细胞Ⅱ型胶原的有效方式。     

胰岛素样生长因子I与透明质酸对人胚关节软骨细胞表型的影响

目的：研究胰岛素样生长因子I(IGF-I)和透明质酸（HA）联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响，判断其稳定软骨细胞表型的效果。方法：分离培养人关节软骨细胞，从第4代开始，用hIGF-I和HA联合培养，通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、II型胶原和aggrecan免疫组化及RT-PCR判断联合培养第8代软骨细胞表型的变化。自然传代的第6代细胞为对照组。结果：IGF-I和HA联合培养的第8代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡；RT-PCR显示II型胶原mRNA表达阳性而I型胶原mRNA表达阴性；甲苯胺蓝染色显示细胞浆内有大量的紫色异染颗粒；II型胶原和aggrecan免疫组化见80％-92％的细胞染色呈阳性或弱阳性，平均灰度分别为85.92和116.23，均显著低于对照组，说明处理组染色较对照组增强。结论：IGF-I和HA联合培养的第8代细胞仍能保持透明软骨细胞的表型，为体外获得高数量级别的有正常功能的人关节软骨细胞提供一种新方法。     

同种异体组织工程化软骨组织的生化分析

目的 以胚胎来源的关节软骨细胞,体内构建同种异体组织工程化软骨组织,分析其与正常关节软骨组织糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原含量的差异。方法 以酶消化法分离胚胎(100 d)山羊关节软骨细胞,与生物材料聚环氧乙烯复合,并植入异体成年山羊腹部皮下。按不同时间段取材,Western-blot、MTT比色法分析测定其GAG和Ⅱ型胶原含量,并与正常关节软骨组织比较。结果 新生软骨中GAG的含量比正常关节软骨显著下降(P<0.01),而Ⅱ型胶原含量与正常关节软骨无显著性差异。结论 胚胎来源的同种异体组织工程化软骨与正常关节软骨有着相同的生化成分,且新生软骨中Ⅱ型胶原的含量与正常关节软骨接近。