人参炔醇联合吉西他滨对胰腺癌干细胞分化及活性的影响

目的: 探讨人参炔醇和吉西他滨联合作用对胰腺癌干细胞(pancreatic cancer stem cell, PCSC)干性及活性的影响。方法: 体外悬浮培养法培养和富集人胰腺癌PANC-1细胞系干细胞,采用荧光激活细胞分选法（fluorescence activated cell sorting,FACS）分选出CD133⁺的细胞亚群;将分选的CD133+细胞分为PBS（对照）组、人参炔醇组、吉西他滨组和人参炔醇与吉西他滨联合组,人参炔醇与吉西他滨最终浓度分别为164 μmol/L,2 μmol/L。流式细胞术检测各组细胞CD133+比例;CCK-8实验检测细胞增殖率;Annexin-V/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测增殖相关蛋白Ki-67及凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。结果： 各组细胞处理48 h后,与对照组相比,人参炔醇组、吉西他滨组和联合组CD133⁺细胞比例明显减少, 而两药联合作用CD133⁺细胞比例减少更显著(P<0.01);人参炔醇和吉西他滨均可抑制胰腺癌PANC-1干细胞增殖并促进细胞凋亡(P<0.05),而联合作用对干细胞增殖能力的抑制作用更显著(P<0.01),促进细胞凋亡更明显(P<0.01);与人参炔醇组和吉西他滨组相比,联合组的Ki-67和Bcl-2表达明显下降。结论： 人参炔醇联合吉西他滨可促进胰腺癌干细胞体外分化,并抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,从而抑制细胞活性。     

Oct4和Nanog基因沉默对胰腺癌干细胞耐药性的影响

目的观察通过RNA干扰同时沉默Oct4和Nanog基斟对胰腺癌干细胞（PCSCs）化疗药物耐药性的影响,探索提高胰腺癌化疗效果的新方法。方法通过流式细胞仪从人胰腺癌细胞系PANC—1中分离出CD44＋CD24＋ESA＋的PCSCs,体外建株,通过构建特异性慢病毒shRNA—Oct4／Nanog载体同时沉默PCSCs的Oct4和Nanog基因,分选出基因沉默的PCSCs（PCSCs—shOct4＋shNanog）,通过CCK8细胞活性检测法观察其对化疗药物吉西他滨敏感性的变化,Real—TimeRT—PCR和Westernblotting检测耐药相关基因ABCG2的表达。结果CD44＋CD24＋ESA＋的PCSCs高度表达Oct4和Nanog基因,在体外表现为对吉西他滨的耐药性增强。Oct4和Nanog基因同时被沉默后PCSCs干性特征出现抑制,ABCG2表达下降,耐药性降低,差异均以统计学意义（P〈0．05）。结论Oct4和Nanog基因在保持PCSCs肿瘤干性特性方面发挥重要作用,沉默二者表达后PCSCs的耐药性受到抑制。     

阿司匹林引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药及其机制研究

目的探讨阿司匹林是否引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药及其可能机制。方法通过四氮唑蓝(MTT)和HOCHEST33258染色方法检测药物对人胰腺癌耐药株SW1990细胞的生长情况以及凋亡的影响;并应用蛋白免疫印迹方法检测细胞信号通路PI3K/AKT的变化。结果阿司匹林能明显降低吉西他滨对细胞的抑制率并提高IC50。0.4μmol/L吉西他滨干预细胞后,凋亡率达56%,明显高于吉西他滨与阿司匹林合用时细胞的凋亡率(28%,P<0.01)。磷酸化AKT和PI3K水平明显增高。PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002能明显逆转阿司匹林引起的SW1990细胞耐受吉西他滨的现象。结论阿司匹林通过激活PI3K/AKT信号通路引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药。     

胚胎干性相关基因在胰腺癌干细胞中的表达变化

目的 观察胚胎干性相关基因Oct4和Nanog在胰腺癌干细胞中的表达变化及意义.方法 将人胰腺癌细胞株PANC-1制备成单细胞悬液,予以CD24、CD44抗体孵育,经流式细胞分选仪分选出CD24+CD44+的胰腺癌干细胞,显微镜下观察于细胞球形成率;以含10％胎牛血清(FBS)培养液诱导干细胞球细胞分化,流式检测CD24和CD44的表达;将细胞分成双阳性干细胞组和未分选组,反转录-PCR和定量PCR检测胚胎干性相关基因Oct4和Nanog mRNA在胰腺癌干细胞中的转录差异;免疫荧光法检测Oct4和Nanog的表达情况;用CCK8法检测上述两组细胞在体外对化疗药物耐受的差异.结果 在人胰腺癌细胞株PANC-1中成功分离出1％～3％ CD24+CD44+的胰腺癌干细胞,在于细胞培养基中呈悬浮球状生长,且与未分选组(93±5)‰相比具有较高的干细胞球形成率[(122±6)‰,P＜0.05],经过血清诱导分化,细胞逐渐恢复原代细胞形态,且CD24、CD44表达下降;胚胎干性相关基因Oct4和Nanog在双阳性干细胞组中高表达;CD24+ CD44+干细胞具有更强的化疗耐受能力(P＜0.05).结论 CD24+ CD44+细胞具有胰腺癌干细胞特性及高耐药性,胚胎干性相关基因Oct4和Nanog在胰腺癌干细胞中高表达且与胰腺癌干细胞干性的维持及高耐药性可能存在高度相关性.     

塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖及干性标记物CD133表达的影响

目的观察环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖及肿瘤干细胞标记物CD133表达的影响。方法取对数生长期的SW1990细胞,分别加入不同浓度的单药吉西他滨、单药塞来昔布、塞来昔布联合吉西他滨进行培养,观察SW1990细胞增殖抑制情况及CD133mRNA、表面分子CD133表达变化。结果不同浓度塞来昔布与吉西他滨(0.500μmol/L)联合应用,对SW1990细胞的增殖抑制作用更为明显,与0.500μmol/L吉西他滨组比较,差异均有显著性(F=339.28～967.22,q=4.48～36.76,P<0.05),与对应剂量的塞来昔布组比较,差异亦均有显著性(q=16.24～66.23,P<0.05)。不同浓度塞来昔布组胰腺癌细胞株SW1990CD133mRNA的表达较对照组明显下调(F=51.84～625.80,q=14.39～45.03,P<0.05),联合应用塞来昔布与吉西他滨(0.500μmol/L)时,其下调作用较各浓度单药塞来昔布减弱,差异有显著性(q=2.85～7.75,P<0.05)。结论塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990的增殖有抑制作用,且与吉西他滨有协同作用;塞来昔布可显著下调SW1990细胞株干细胞表面标记物CD133mRNA的表达。     

基于基因芯片的乳腺癌干细胞miRNAs检测分析

目的 利用流式细胞仪(FACS)细胞分选技术从乳腺癌细胞株MCF-7中分选乳腺癌干细胞,并利用基因芯片进行其miRNAs表达谱分析.方法 利用已知的乳腺癌干细胞的表面分子标志(CD44 ESA CD24-/low),以相应的荧光标记抗体对细胞加以标记,FACS细胞分选获得乳腺癌干细胞,NOD-SCID移植瘤实验进行干细胞功能鉴定;分别提取细胞总RNA以及小分子RNA,经荧光标记后与miRNAs基因芯片杂交,获得乳腺癌干细胞miRNAs表达谱.结果 从MCF-7中分选到约1%的CD44 ESA CD24-/low细胞,NOD-SCID移植瘤实验表明其具有干细胞特性,基因芯片杂交获得20个乳腺癌干细胞相关miRNAs,其中4个为低表达,16个为高表达.结论 乳腺癌干细胞具有自身特征性miRNAs,为进一步从干细胞层面研究乳腺癌发病机制及靶向治疗打下基础.     

耐吉西他滨胰腺癌细胞株SW1990/GZ上皮间质转化现象的研究

目的:观察耐吉西他滨胰腺癌细胞株(SW1990/GZ)上皮间质转化的现象?方法:倒置显微镜下观察亲代SW1990细胞与SW1990/GZ细胞的形态差别;流式细胞仪检测细胞周期;免疫印迹法(Western blot)检测上皮间质转化相关蛋白表达;Transwell小室测定细胞侵袭迁移能力;通过表面特异抗原(CD44+?CD24+和CD133+)标记流式细胞仪检测肿瘤干细胞比例?结果:在形态学上,SW1990/GZ表现出明显的间质细胞特征,与亲代SW1990相比处于G1期的细胞无明显差异;SW1990/GZ细胞低表达上皮细胞标志物E-cadherin,而高表达间质细胞的标记物Vimentin;SW1990/GZ细胞侵袭和迁移能力明显增强(P < 0.01);与亲代细胞SW1990相比,SW1990/GZ细胞中CD44+CD24+细胞比例以及CD133+细胞比例分别提高了2倍和4倍以上(P < 0.01)?结论:SW1990耐吉西他滨细胞株(SW1990/GZ)发生了明显的上皮间质转化过程,肿瘤干细胞比例明显增多?     

肝癌干细胞CD90+和ESA+亚群生物学特性研究

目的　研究肝癌干细胞不同亚群CD90+和ESA+细胞的生物学特性,为肝癌的治疗及预后判定提供新的思路。方法　采用活细胞流式细胞术检测肝癌细胞系MHCC97L中肝癌干细胞标志物CD90、ESA的表达情况,并分选ESA+,CD90+细胞,通过甲基纤维素成球实验、Transwell、CCK8法进行体外生物学特征研究。结果　肝癌细胞系MHCC97L中CD90+和ESA+细胞表达比例分别为2.37%和3.70%。ESA+细胞成球率明显高于ESA-细胞［成球率（35.6±2.1）% vs.（9.6±1.4）%, P<0.01］,CD90+细胞成球率明显高于CD90-细胞［成球率（29.2±1.3）% vs.（7.4±0.6）%］（P<0.01）,ESA+细胞成球率明显高于CD90+细胞且ESA+细胞sphere球体积明显大于CD90+细胞体积;ESA+细胞较ESA-细胞侵袭能力提高2.12倍［（282±15.1 vs. 133±12.4）,P<0.01］,CD90+细胞较CD90-细胞侵袭能力提高2.04倍［（231±18.1 vs. 113±10.2）,P<0.01］。CD90+细胞耐药性明显强于ESA+细胞［IC50（0.98 μg/mL vs. 0.36 μg/mL）］,ESA+细胞增殖能力明显强于CD90+细胞。结论　肝癌组织中存在不同的干细胞亚群ESA+细胞及CD90+细胞,这些亚群具有不同的生物学特性,影响肝癌的耐药、侵袭,了解肝癌中不同干细胞亚群的表达情况可用于指导临床个体化治疗。     

吉西他滨联合槲皮素对胰腺癌细胞Panc-1凋亡的影响研究

目的研究吉西他滨联合槲皮素抑制胰腺癌细胞Panc-1增殖,促进其凋亡的效果.方法设立槲皮素(终浓度为50μM)、吉西他滨(50μg/ml)、吉西他滨联合槲皮素和对照组4组,MTS法检测药物对Panc-1细胞凋亡的影响,流式细胞仪检测联合药物处理对细胞凋亡和细胞周期的影响,最后应用荧光定量PCR法测定凋亡相关基因BCL-2家族蛋白的相对表达.结果吉西他滨联合槲皮素后,对胰腺癌促凋亡效果增强,同时改变细胞周期,使其S期减少,BCL-2家族促凋亡基因表达上调.结论槲皮素能够显著增强吉西他滨抑制胰腺癌恶性增殖的作用.     

普伐他汀对人胰腺癌细胞SW1990的影响及其协同吉西他滨的抑瘤作用

目的研究普伐他汀(pravastatin,Pra)对人胰腺癌细胞SW1990增殖和凋亡的影响及其联合吉西他滨(gemcitabine,GEM)对该细胞的作用。方法MTT比色法测定普伐他汀对SW1990细胞生长的抑制作用。不同浓度普伐他汀处理细胞48 h后,流式细胞仪测定细胞凋亡率,光学显微镜下观察细胞形态学改变。吉西他滨、普伐他汀联合吉西他滨作用细胞48 h,MTT法测定各处理组的OD值,并计算相互作用指数。结果 MTT比色法显示普伐他汀对SW1990细胞具有抑制增殖的作用,5、15、25μmol/L普伐他汀处理SW1990细胞后,SW1990细胞出现典型的形态学改变,且凋亡百分率随浓度增大而逐渐增加。普伐他汀联合吉西他滨作用细胞后,GEM的IC50值降低。结论普伐他汀具有抑制胰腺癌细胞SW1990增殖和诱导该细胞凋亡的作用,普伐他汀联合吉西他滨对SW1990细胞具有协同抗瘤作用。     

细胞免疫荧光检测人胰腺癌干细胞Oct4､Nanog基因的表达

目的:研究胚胎干细胞相关基因Oct4和Nanog在人胰腺癌肿瘤干细胞和普通肿瘤细胞中表达的差异?方法:用流式细胞仪在人胰腺癌Panc-1细胞系中分选肿瘤干细胞,细胞免疫荧光法检测2种肿瘤干细胞和Panc-1细胞中Oct4?Nanog基因的表达情况?结果:Oct4及Nanog基因在2种分选出的细胞中表达均高于未分选细胞?结论:干细胞相关基因Oct4?Nanog在胰腺癌Panc-1肿瘤干细胞中的表达高于普通胰腺癌细胞?     

健择诱导人胰腺癌细胞凋亡的实验研究

目的 探讨健择(盐酸吉西他滨)诱导胰腺癌细胞凋亡可能的途径.方法 采用RT-PCR、Western-blot及激光密度扫描技术、Annexin Ⅴ-FITC/ PI双染法对健择诱导胰腺癌Panc-1细胞发生凋亡过程中caspase-3、bax和survivin基因表达及细胞凋亡率进行了检测分析.结果 健择可以诱导胰腺癌细胞发生凋亡,5 mg/L组24 h凋亡率达(18.83±0.78)%,凋亡率随健择浓度升高而升高,25 mg/L组在用药48 h后凋亡率高达(42.47±2.77)%.并且caspase-3、bax基因表达量随细胞凋亡的发生而升高, 与健择的浓度成正比关系;但survivin基因表达量随细胞凋亡的发生而降低,与健择的浓度成反比关系.结论 凋亡调节基因bax、caspase-3的上调及survivin的下调可能与健择诱导胰腺癌细胞凋亡有关系.     

人卵巢肿瘤细胞系3AO中肿瘤干细胞的分离鉴定

目的利用CD133抗体偶联的免疫磁珠分选法从人卵巢肿瘤3AO细胞系中分离CD133+细胞,并且通过检测其抗凋亡能力和耐药性进一步鉴定其特征。方法通过免疫磁珠分选方法分离人卵巢肿瘤细胞系中CD133+肿瘤干细胞,流式细胞仪检测肿瘤干细胞自我更新能力和抗凋亡能力,裸鼠移植实验反映成瘤性,MTT法检测其耐药性。结果通过免疫磁珠手段可成功分离得到CD133+卵巢肿瘤肿瘤干细胞,细胞增殖活力好,自我更新能力强,随着培养时间的延长可产生大量的CD133-细胞。裸鼠移植成瘤实验表明CD133+细胞成瘤率是10/10,成瘤平均时间是(58±6)d;而CD133-成瘤率是4/10,平均成瘤时间是(145±8)d,CD133+细胞成瘤能力明显强于CD133-细胞。MTT检测结果表明CD133+细胞的IC50值为CD133-细胞的2.5倍左右,提示对顺铂药物不敏感。对使用顺铂的细胞进行吖啶橙染色后发现,大量CD133-细胞呈现细胞凋亡状态,而CD133+细胞形态基本正常。进一步的AnnexinⅤ-FITC和PI双染结果表明,药物处理后的CD133+细胞比CD133-细胞具有更强的抗凋亡能力。结论免疫磁珠分选得到的CD133+细胞具有自我更新、增殖和分化为CD133-细胞等肿瘤干细胞的特征。CD133+细胞比CD133-细胞具有较强的成瘤能力、耐药性及抗凋亡能力。     

基因芯片技术筛选和鉴定CD133+CD200+大肠癌干细胞相关基因

目的筛选CD133+CD200+大肠癌细胞并鉴定其相关基因的表达。方法流式细胞术分选CD133+CD200+和CD133-CD200-
大肠癌细胞,应用Affymetrix 人类全基因组表达谱芯片检测这两群细胞的基因表达谱,初步筛选CD133 +CD200 +与
CD133-CD200-大肠癌细胞之间的差异表达基因,进而寻找与大肠癌干细胞特异性相关的主效基因,最后利用qRT-PCR实验对
部分差异表达基因进行验证,以确定芯片检测结果的可靠性。结果芯片结果显示差异在3倍以上的基因共655个,CD200+细胞
表达上调的基因290 个,表达下调的基因共365 个,通过生物信息学分析和GENEMANIA共表达构建,筛选出3 条（MDM2;
PRKACG;CACNA1G）有特异相关的差异基因进行qRT-PCR验证,结果与芯片结果完全相符。结论基因芯片技术通过筛选和
鉴定CD133+CD200+大肠癌干细胞相关基因,建立了特异性大肠癌干细胞基因表达谱,为大肠癌基因靶向治疗及进一步研究提
供依据。
     

CD133+细胞在局部晚期结肠癌中的异常表达

目的 探讨CD133+肿瘤细胞对结肠癌患者预后的影响。方法 收集有完整随访资料的104例IIIB期(T3-4N1M0)结肠癌根治术后石蜡包埋组织标本及临床资料,采用免疫组化方法检测癌组织及邻近癌旁相对正常组织中CD133抗原的表达情况,分析其与患者临床特征和预后的关系。结果 肿瘤组织中的CD133+肿瘤细胞比较少见而且分布不均匀。CD133染色见于结肠癌细胞膜的腺腔面及基底,在癌巢"出芽"处及有腺管结构的低分化腺癌也可见CD133染色。生存分析显示CD133及T分期都是IIIB结肠癌的独立预后因素。肿瘤组织中CD133+细胞＜5%的患者5年生存率较高（77.4%）,≥ 5％则为45.2%。CD133的表达与其他临床病理参数均无相关性。结论 CD133+肿瘤细胞是IIIB期结肠癌患者5年生存率的独立预后因素, CD133+肿瘤细胞促进了IIIB期结肠癌的进展。     

外源性Muc1、Survivin和Nanog基因启动子在结肠癌干细胞中的表达活性

目的 探讨结肠癌干细胞中不同基因启动子的活性,寻找可能用于结肠癌干细胞靶向治疗的启动子.方法 应用流式细胞仪分选人结肠癌HCT116细胞系中CD133+ CD44+标记的肿瘤干细胞.采用PCR技术获取Nanog、Muc1和Survivin基因启动子并分别克隆入pGL3-basic质粒.将含有启动子的pGL3-basic质粒和pGL3-control质粒分别与pRL-sv40共转染结肠癌细胞(HCT116、SW620、HT29)、结肠癌干细胞(CD133+ CD44+ HCT116)及人正常肝细胞(QSG7701),通过检测双荧光素酶活性以测定启动子活性.结果 pGL3-basic-Nanog、pGL3-basic-Muc1、pGL3-basic-Survivin经测序鉴定正确.HCT116细胞系中CD133+ CD44+细胞比率约占42.2％.双荧光素酶活性检测显示:在HCT116、SW620、HT29和CD133+ CD44+ HCT116细胞中,Muc1与Survivin均表现出了较强的活性,而在正常细胞QSG7701中活性较低.结论 Muc1、Survivin启动子可能是用于靶向结肠癌干细胞治疗的有效候选启动子.